Perfilado de expresión génica específico del tipo de celda en el hígado del ratón
Summary
La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) permite un aislamiento rápido y eficiente del ARNm de traducción específico del tipo de célula. Aquí, demostramos un método que combina la inyección hidrodinámica de cola-vena en un modelo de ratón de repoblación hepática y TRAP para examinar el perfil de expresión de los hepatocitos repoblados.
Abstract
La repoblación hepática después de una lesión es una característica crucial de los mamíferos que evita la falla inmediata de los órganos y la muerte después de la exposición de toxinas ambientales. Una comprensión más profunda de los cambios en la expresión génica que se producen durante la repoblación podría ayudar a identificar dianas terapéuticas para promover la restauración de la función hepática en el entorno de lesiones. Sin embargo, los métodos para aislar específicamente los hepatocitos repobladores se ven inhibidos por la falta de marcadores celulares, números celulares limitados y la fragilidad de estas células. El desarrollo de la tecnología de traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) en conjunto con el modelo de ratón Fah-/- para recapitular la repoblación en el entorno de la lesión hepática permite el perfil de expresión génica de la repoblación Hepatocitos. Con TRAP, el ARNm de traducción específico del tipo de celda se aísla rápida y eficientemente. Desarrollamos un método que utiliza TRAP con aislamiento basado en afinidad de traducir mRNA de hepatocitos que expresan selectivamente la proteína fluorescente verde (GFP) con etiqueta de proteína ribosomal (RP), GFP:RPL10A. TRAP elude el largo período de tiempo requerido para la clasificación celular activada por fluorescencia que podría cambiar el perfil de expresión génica. Además, dado que sólo los hepatocitos repobladores expresan la proteína de fusión GFP:RPL10A, el ARNm aislado está desprovisto de contaminación de los hepatocitos heridos circundantes y otros tipos de células en el hígado. El ARNm purificado por afinidad es de alta calidad y permite el análisis basado en la secuenciación descendente de PCR o de alto rendimiento de la expresión génica.
Introduction
Como el principal órgano metabólico en vertebrados, el hígado es responsable de la homeostasis de glucosa, síntesis de proteínas séricas, secreción de ácido biliar, y metabolismo xenobiótico y desintoxicación. El hígado posee una capacidad extraordinaria para regenerar el parénquima lesionado al exponerse a toxinas para prevenir la insuficiencia hepática inmediata1. Sin embargo, el fracaso de la regeneración puede ocurrir en el entorno de paracetamol o consumo excesivo de alcohol, que puede conducir a insuficiencia hepática aguda2. Además, la lesión hepática crónica causada por la infección por hepatitis viral, la enfermedad del hígado graso y la esteatohepatitis puede causar fibrosis hepática, cirrosis y carcinoma hepatocelular3. El único tratamiento curativo disponible para la enfermedad hepática terminal es el trasplante, pero está limitado por la escasez de órganos, lo que impide un tratamiento eficiente para todos los pacientes4. Por lo tanto, una mejor comprensión del proceso de recuperación después de una lesión hepática tóxica es crucial para el desarrollo de tratamientos para estimular la regeneración suficiente para la función de rescate en el órgano enfermo.
El sistema modelo más ampliamente aplicado para el estudio de la regeneración hepática es la hepatectomía parcial en roedores, en la que una gran proporción del hígado se resecta para estimular la rápida expansión de los hepatocitos5. Sin embargo, la hepatoectomía parcial no recapitula la expansión de los hepatocitos después de una lesión hepática tóxica debido a la falta de infiltración de células inmunitarias y necrosis celular de hepatocitos a menudo observada en el entorno de lesión hepática aguda en humanos6. Un sistema más adecuado para modelar esta forma de renovación de órganos es el ratón Fah-/-, que carece de fumarylacetoacetato hidrolasa funcional (FAH) necesario para el metabolismo adecuado de la tirosina y desarrolla daño hepático grave que conduce a la muerte7. Estos ratones se pueden mantener en un estado saludable indefinidamente por el tratamiento con el medicamento nitisinona en el agua potable. Alternativamente, la expresión DE FAH se puede restaurar mediante la entrega transgénica a un subconjunto de hepatocitos, que se expandirán para repoblar el hígado tras la eliminación de nitisinona8.
Para perfilar los cambios en la expresión génica de los hepatocitos repoblados, se requiere una herramienta para aislar específicamente los hepatocitos replicantes en el ratón Fah-/- sin contaminación de los hepatocitos heridos vecinas y otros tipos de células. Desafortunadamente, la clasificación celular asistida por fluorescencia (FACS) de hepatocitos es difícil ya que (1) la fragilidad de repoblar hepatocitos conduce a una mala recuperación después de la perfusión hepática, (2) replicar hepatocitos son muy variables en tamaño, haciendo que el aislamiento de una población pura por FACS difícil, y (3) el tiempo de procedimiento de la perfusión hepática al aislamiento de ARN es mayor que 2 h, por lo tanto los perfiles de expresión génica pueden sufrir cambios artificiales sustanciales antes de que se adquieran muestras9.
Alternativamente, la expresión de ribosomas etiquetados con epítopos específicamente en la repoblación de hepatocitos permite el aislamiento rápido de traducir activamente el ARNm unido por ribosomas utilizando la purificación de afinidad inmediatamente después de la cosecha de órganos, con hígado a granel tejidos. Aquí, describimos un protocolo para realizar la purificación de afinidad de traducción-ribosoma (TRAP)10 seguido de la secuenciación de ARN de alto rendimiento (TRAP-seq), para aislar y perfilar específicamente el ARNm en la repoblación de hepatocitos en el Fah-/- ratón9. La coexpresión de proteína ribosomal con etiqueta de proteína fluorescente verde (GFP:RPL10A) con FAH permite la purificación de afinidad de la traducción de ARNm unido por polisomas que contienen GFP:RPL10A. Este método evita cualquier paso de disociación celular, como la perfusión hepática para aislar los hepatocitos repobladores frágiles. En su lugar, utiliza lisis de tejido de órganoentero y anticuerpos para extraer rápidamente el ARN específicamente de las células diana. Por último, el aislamiento de ARNm abundante y de alta calidad a través de TRAP-seq permite que las aplicaciones posteriores, como el análisis de secuenciación, perfilen el cambio dinámico de la expresión génica durante el proceso de repoblación.
Protocol
Representative Results
Discussion
TRAP-seq es una técnica para el aislamiento específico del tipo de celda de la traducción de ARNm a través de ribosomas etiquetados con epítopos y presenta una alternativa a los enfoques FACS, ya que elude limitaciones como los requisitos de tiempo de FACS9. En su lugar, TRAP permite el aislamiento rápido y eficiente del ARN directamente de los tejidos a granel, ayudando a evitar cualquier alteración en la expresión génica. TRAP-seq es especialmente adecuado para su uso en el repoblado h?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por las siguientes subvenciones: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AMZ), K08-DK106478 (KJW) y P30-DK050306 (Subvención piloto a KJW).
Materials
| 10 mL Tissue Grinder, Potter-Elv, Coated | DWK Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Absolutely RNA Miniprep Kit | Agilent | 400800 | |
| Anti-GFP antibodies | Memorial Sloan-Kettering Antibody & Bioresource Core | GFP Ab #19C8 and GFP Ab #19F7 | |
| Bovine Serum Albumin, IgG-Free, Protease-Free | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Deoxycholic acid, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-Glucose, Dextrose | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-Dithiothreitol | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Petri Dishes with Clear Lid | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcium, magnesium, no phenol red | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, 1M Solution, pH 7.3, Molecular Biology Grade, Ultrapure, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| Magnesium chloride, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonylphenyl polyethylene glycol, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Nuclease-Free Water, not DEPC-Treated | Ambion | AM9932 | |
| Overhead Stirrer | DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | |
| PBS Buffer (10x), pH 7.4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce Recombinant Protein L, Biotinylated | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Potassium chloride, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagents | Agilent | 5067-1513 | |
| RNaseZap RNase Decontamination Solution | Invitrogen | AM9780 | |
| RNasin Ribonuclease Inhibitors | Promega | N2515 | |
| Sodium azide, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase·In RNase Inhibitor | Invitrogen | AM2694 | |
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