La traduzione della purificazione dell'affinità dei ribosomi (TRAP) consente un isolamento rapido ed efficiente dell'mRNA di traslazione specifico del tipo di cellula. Qui, dimostriamo un metodo che combina l'iniezione idrodinamica della vena della coda in un modello murino di ripopolamento e del trap per esaminare il profilo di espressione degli epatociti ripopolamento.
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Articolo metodologico
Profiling dell'espressione genica specifica del tipo di cella nel fegato del mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
Il ripopolamento del fegato dopo lesioni è una caratteristica cruciale dei mammiferi che previene l'insufficienza e la morte immediata degli organi dopo l'esposizione di tossine ambientali. Una comprensione più approfondita dei cambiamenti nell'espressione genica che si verificano durante il ripopolamento potrebbe aiutare a identificare gli obiettivi terapeutici per promuovere il ripristino della funzione epatica in caso di lesioni. Ciò nonostante, i metodi per isolare specificamente gli epatociti ripopolati sono inibiti dalla mancanza di marcatori cellulari, da un numero limitato di cellule e dalla fragilità di queste cellule. Lo sviluppo della tecnologia trap (Rato) di traduzione della purificazione dell'affinità riboscanda (TRAP) in combinazione con il modello murino Fah-/- per ricapitolare il ripopolamento del ripopolamento nell'impostazione delle lesioni epatiche consente la profilazione genica del ripopolamento Epatociti. Con trap, l'mRNA di traduttura specifico del tipo di cellula è isolato rapidamente ed efficacemente. Abbiamo sviluppato un metodo che utilizza trap con isolamento basato sull'affinità di traduzione di mRNA da epatociti che esprimono selettivamente la proteina ribosomica marcata GFP (GFP) (RP), GFP:RPL10A. TRAP aggira il lungo periodo di tempo necessario per lo smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza che potrebbe cambiare il profilo dell'espressione genica. Inoltre, poiché solo gli epatociti che ripopolano esprimono la proteina di fusione GFP:RPL10A, l'mRNA isolato è privo di contaminazione dagli epatociti feriti circostanti e da altri tipi di cellule nel fegato. L'mRNA purificato dall'affinità è di alta qualità e consente l'analisi pcR o ad alta velocità pcR o ad alta velocità dell'espressione genica.
Introduzione
Come principale organo metabolico nei vertebrati, il fegato è responsabile dell'omeostasi del glucosio, sintesi proteica del siero, secrezione dell'acido biliare e metabolismo xenobiotico e disintossicazione. Il fegato possiede una straordinaria capacità di rigenerare il parenchyma ferito dopo l'esposizione alle tossine per prevenire l'insufficienza epatica immediata1. Tuttavia, il fallimento della rigenerazione può verificarsi nella cornice di acetaminofene o consumo eccessivo di alcol, che può portare a insufficienza epatica acuta2. Inoltre, lesioni epatiche croniche causate da infezione da epatite virale, malattia del....
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Protocollo
Tutti i metodi che prevedono l'uso di topi sono coerenti con le linee guida fornite dall'IACUC dell'Ufficio Penn per il Benessere degli Animali dell'Università della Pennsylvania.
1. Preparazione del reagente
-
Ciclolosmide
- Per fare 500 l of 0,1 g/mL ciclossimide, sospendere 50 mg di ciclossimide in 500 - L di metanolo.
ATTENZIONE: La ciclologimide è estremamente tossica per l'ambiente e può causare malformazioni congenite. Tutti i rifiuti e le tamponamenti contenenti cicloseximide devono essere raccolti per un corretto smaltimento.
NOT: La cicloxessimide può essere ....
- Per fare 500 l of 0,1 g/mL ciclossimide, sospendere 50 mg di ciclossimide in 500 - L di metanolo.
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Risultati
Per profilare l'espressione genica nel ripopolamento degli epatociti del topo Fah-/-, la fusione Gfp:Rpl10a e le transgenie Fah sono co-consegnate all'interno di un plasmide contenente trasposoni8 (vettore TRAP) ai fegati iniezione idrodinamica (Figura 1A). La rimozione del nitisinone induce una lesione epatica tossica che crea una pressione di selezione per gli epatociti che espri.......
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Discussione
IL TRAP-seq è una tecnica per l'isolamento specifico del tipo di cellula della traduzione dell'mRNA tramite ribosomi con tag epipito e presenta un'alternativa agli approcci FACS, in quanto elude limitazioni come i requisiti di tempo di FACS9. Invece, TRAP consente un rapido ed efficiente isolamento dell'RNA direttamente dai tessuti sfusi, contribuendo a evitare qualsiasi alterazione nell'espressione genica. TRAP-seq è particolarmente adatto per l'uso nel ripopolante fegato di topo Fah-/-,.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalle seguenti sovvenzioni: F31-DK113666 (AWW), K01-DK102868 (AM) , K08-DK106478 (KJW) e P30-DK050306 (Pilot grant to KJW).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Macinatore di tessuti da 10 mL, Potter-Elv, DWK rivestito | Life Sciences (Wheaton) | 358007 | |
| Kit di minipreparazione assolutamente RNA | Anticorpi Agilent | 400800 | |
| Anticorpi anti-GFP | Anticorpo Memorial Sloan-Kettering e Bioresource Core | GFP Ab #19C8 e GFP Ab #19F7 | |
| Albumina sierica bovina, senza IgG, senza proteasi | Jackson ImmunoResearch | 001-000-162 | |
| cOmplete, Mini, senza EDTA Proteasi Cocktail | Roche | 11836170001 | |
| Cycloheximide | Millipore Sigma | C7698 | |
| Acido desossicolico, DOC | Millipore Sigma | D2510 | |
| D-glucosio, destrosio | Fisher Scientific | D16 | |
| DL-ditiotreitolo | Millipore Sigma | D9779 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin T1 | Thermo Fisher Scientific | 65602 | |
| Fisherbrand Piastre di Petri con coperchio trasparente | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| HBSS (10x), calcio, magnesio, senza fenolo rosso | Thermo Fisher Scientific | 14065-056 | |
| HEPES, soluzione 1 M, pH 7,3, grado di biologia molecolare, ultrapuro, Thermo Scientific | Thermo Fisher Scientific | AAJ16924AE | |
| cloruro di magnesio, MgCl2 | Millipore Sigma | M8266 | |
| Metanolo | Fisher Scientific | A452 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spettrofotometro | Thermo Fisher Scientific | VV-83061-00 | |
| NEBNext Poly(A) mRNA Modulo di isolamento magnetico | New England BioLabs | E7490S | |
| NEBNext Kit di preparazione della libreria Ultra RNA per Illumina | New England BioLabs | E7530S | |
| Nonilfenil polietilenglicole, NP-40. IGEPAL CA-630 | Millipore Sigma | I8896 | |
| Acqua priva di nucleasi, non trattata con DEPC | Agitatore ad asta Ambion | AM9932 | |
| DWK Life Sciences (Wheaton) | 903475 | ||
| tampone PBS (10x), pH 7,4 | Ambion | AM9625 | |
| Pierce proteina ricombinante L, biotinilato | Thermo Fisher Scientific | 29997 | |
| Cloruro di potassio, KCl | Millipore Sigma | P4504 | |
| RNA 6000 Pico Kit & Reagenti | Agilent | 5067-1513 | |
| Soluzione di decontaminazione RNaseZap RNasi | Invitrogen | AM9780 | |
| Inibitori della RNasina ribonucleasi Promega | N2515 | ||
| Azide di sodio, NaN3 | Millipore Sigma | S2002 | |
| Bicarbonato di sodio, NaHCO3 | Millipore Sigma | S6297 | |
| SUPERase· Nell'inibitore della RNasi | Invitrogen | AM2694 |
Riferimenti
- Taub, R. Liver regeneration: from myth to mechanism. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).
- Lee, W. M. Etiologies of acute liver failure. Seminars in Liver Disease. 28 (2), 142-152 (2008).
- Sanyal, A. J., Yoon, S. K., Lencioni, R.
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Ristampe e permessi
