التزجيج الحبريه السائبة للحفاظ علي الخلايا الكبدية الاساسيه
Summary
تصف هذه المخطوطة طريقه الحفظ بالتبريد الخالية من الجليد للكميات الكبيرة من خلايا الكبد الفئران التي يتم فيها الاحتضان المسبق للخلايا الاوليه مع عوامل كريوبروتيكتيفي بتركيز منخفض والمزجج في قطرات كبيره.
Abstract
التزجيج هو بديل الجليد خاليه واعده لتجميد الكلاسيكية بطيئه (في حوالي 1 درجه مئوية/دقيقه) بالتبريد من العينات البيولوجية. ويتطلب التزجيج معدلات تبريد سريعة للغاية لتحقيق انتقال المياه إلى المرحلة الزجاجية مع تجنب تشكيل الجليد الضار. علي الرغم من ان مرحله ما قبل الحضانة مع وكلاء كريوبروتيكتيفي (CPA) يمكن ان تقلل من معدل التبريد الحرجة من العينات البيولوجية ، وهناك حاجه عموما إلى تركيزات عاليه لتمكين الجليد خاليه من البرد التجميد عن طريق التزجيج. ونتيجة لذلك ، فان التزجيج يعوقه التسمم ببموجب اتفاق السلام الشامل ويقتصر علي العينات الصغيرة التي يمكن تبريدها بسرعة. وقد تبين مؤخرا ان هذه القيود المتاصله يمكن التغلب عليها بواسطة التزجيج التجميعي السائب. باستخدام هذه الطريقة الجديدة ، يتم أولا احتضان الخلايا مع تركيز CPA منخفض داخل الخلايا. الاستفادة من الجفاف السريع الاسموزي ، تتركز التكلفة النسبية للاكتساب داخل الخلايا مباشره قبل التزجيج ، دون الحاجة إلى تتوازن تركيزات التكلفة الكلية السامة بالبالكامل. يتم تنفيذ الجفاف الخلوية في جهاز فلويدريك ومتكاملة مع توليد الانتاجيه العالية المستمر من قطرات كبيره الحجم التي يتم المزجج في النيتروجين السائل. هذه الطريقة الخالية من الجليد بالتبريد مع سميه الحد الأدنى للاكتساب مناسبه لكميات الخلايا الكبيرة والنتائج في زيادة القدرة علي البقاء في الكبد ووظيفة التمثيل الأيضي بالمقارنة مع الكلاسيكية بطيئه تجميد التبريد. تصف هذه المخطوطة أساليب التزجيج التجميعي الناجح للقطرة السائبة بالتفصيل.
Introduction
فقدان القدرة علي البقاء في الخلية والتمثيل الأيضي بعد التجميد من الخلايا الكبدية لا تزال قضية رئيسيه التي تحد من التطبيقات السريرية1,2,3. الطريقة القياسية لحفظ الخلايا الكبدية هي بطيئه التجمد ، والتي يتم تنفيذها قبل احتضان الخلايا الكبدية مع CPA (ثنائي ميثيل سلفوكسيد [dmso] ، والجلوكوز ، والزلال) وتجميد معدل اللاحقة (في حوالي 1 درجه مئوية/دقيقه) درجاتالحرارة المبردة 4,5. علي الرغم من العديد من التحسينات المبلغ عنها ، وسميه CPA مع الاختلالات الاسموزي الضارة اثناء تجميد والإجهاد الميكانيكي لتشكيل الجليد لا تزال العيوب الاساسيه لبطء تجميد6،7.
[تزجيج] يقدم ميزه علي [سلو-فريز] في ان أصابه واجبه إلى جليد تشكيل يكون تماما تفاديت بمباشره طور انتقال الماء داخل الزجاج دوله6. ومع ذلك ، للوصول إلى درجه حرارة التحول الزجاج من المياه النقية (-137 درجه مئوية) ، يجب تبريد المياه بمعدلات بترتيب 1,000,000 درجه مئوية في الثانية (اي معدل التبريد الحرجة) لتجنب تشكيل الجليد فوق درجه حرارة التحول الزجاج8 . أضافه CPAs يمكن ان تخفض معدل التبريد الحرجة وزيادة درجه حرارة التحول الزجاج من الحلول المائية9. ومع ذلك ، حتى مع تركيزات تكلفه الاكتساب العالية (علي سبيل المثال ، 40 ٪ v/v dmso أو اعلي) ومع ذلك فان معدلات التبريد السريع مطلوبه لعمليه التزجيج الناجحة8،9.
وتؤدي معدلات التبريد المطلوبة وتركيزات CPA العالية إلى عيبين رئيسيين في التزجيج. أولا ، لتمكين التبريد السريع ، يجب ان تكون العينات كتله حراريه منخفضه. ثانيا ، للوصول إلى تركيزات CPA عاليه مع تجنب الاصابه الاسموزي ، يجب إدخال CPAs ببطء ومعايرتها بالبالكامل بين المقصورات داخل وخارج الخلية6. وهذا يزيد من وقت التعرض للخلايا إلى CPAs السامة. معا ، وهذا يجعل التزجيج عمليه مرهقه التي تقتصر علي عدد قليل من العينات الصغيرة الحجم (ميكروليتر) في وقت واحد. وقد اقترح التزجيج التجميعي كحل محتمل لهذه القيود. من خلال تعريض قطرات الخلايا الضئيلة الحجم (نانولتر) إلى النيتروجين السائل ، فان معدل التبريد يزداد بشكل ملحوظ ، مما يسمح بالتالي بتخفيض كبير في تركيز CPA10،11،12 و13و14. علي الرغم من ان العديد من فوات توليد القطرات عاليه التردد يمكن استخدامها في وقت واحد ، فان حجم القطيرات الصغير للغاية يحد من الانتاجيه إلى ميكروليتر في الدقيقة10، مما يمنع التزجيج الفعال للخلية الكبيرة وحدات التخزين بمقادير اعلي من معدلات المعالجة بترتيب ملليلتر في الدقيقة.
وقد تبين مؤخرا ان هذه القيود المتاصله في التزجيج يمكن التغلب عليها بواسطة التزجيج التجميعي للقطيرات السائبة15. هذه الطريقة الجديدة تعزز الجفاف الاسموزي السريع للتركيز علي تركيز CPA داخل الخلايا من 7.5 ٪ v/v جلايكول الاثيلين و DMSO السابقة مباشره التزجيج ، والقضاء علي الحاجة إلى تاخيرمن كامله من تركيزات CPA السامة. يتم اجراء الجفاف الخلوي في جهاز فلويدريك عن طريق التعرض قصيرة من خلايا الكبد إلى تركيز CPA عاليه الخلية. علي الرغم من ان هذا التعرض يسبب الجفاف الاسموزي السريع ، فانه قصير جدا لتركيز CPA عاليه لتنتشر في الخلايا. مباشره بعد الجفاف ، يتم تحميل الخلايا في قطرات التي يتم المزجج مباشره في النيتروجين السائل. هذا الأسلوب يلغي الحاجة إلى الاستيعاب الكامل داخل الخلايا من تركيزات CPA عاليه في حين ان تركيز CPA عاليه الخلية تمكن من التزجيج من قطرات كبيره الحجم ، مما ادي إلى كميات عاليه الانتاجيه مع الحد الأدنى من سميه CPA.
التزجيج الحبريه يحسن القدرة علي البقاء المباشر وعلي المدى الطويل بعد الحفاظ عليها ، فضلا عن المورفولوجية ووظيفة الأيض من الخلايا الكبدية الرئيسية الفئران بالمقارنة مع الحفظ الكلاسيكي بالتبريد ببطء تجميد15. تقدم هذه المخطوطة التفاصيل المنهجية للتزجيج الحبريه السائبة من خلايا كبديه الفئران الاوليه.
Protocol
Representative Results
Discussion
الحفظ بالتبريد من خلايا الكبد ببطء تجميد النتائج في انخفاض القدرة علي البقاء والتمثيل الأيضي وظيفة. يقدم التزجيج بديلا واعدا للحجز الكلاسيكي بالتبريد ، حيث يتم تجنب الاصابه بالتجمد تماما9. ومع ذلك ، مطلوب الحضانة مع CPAs لخفض معدل التبريد الحرجة8. التالي ، فان التس?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
التمويل من المعاهد الوطنية الامريكيه للصحة (R01DK096075, R01DK107875, و R01DK114506) ووزارة الدفاع الامريكيه (وزاره الخارجية RTRP W81XWH-17-1-0680) ومن المسلم به إلى حد كبير.
Materials
| BD Disposable 3 mL Syringes with Luer-Lok Tips | Fisher Scientific | 14-823-435 | |
| Beaker | Sigma-Aldrich | CLS1000-250 | |
| Belzer UW Cold Storage Solution | Bridge to Life | BUW-001 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Cole-Parmer Female Luer to 1/16" low-profile semi-rigid tubing barb, PP | Cole-Parmer | EW-45508-12 | |
| Cryogentic stroage tank / Cryotank | Chart Industries | MVE 800 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DMEM, powder, high glucose, pyruvate | Life Technologies | 12800-082 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich | 107-21-1 | |
| Extra long forceps | Fisher Scientific | 10-316C | |
| Fisherbrand Higher-Speed Easy Reader Plastic Centrifuge Tubes – Flat top closure | Fisher Scientific | 06-443-18 | |
| Fishing line | Stren | SOFS4-15 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | 7727-37-9 | |
| Masterflex L/S Platinum-Cured Silicone Tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | |
| Mix Tips, For Use With 3HPW1 | Grainger | 3WRL7 | |
| Nalgene Polypropylene Powder Funnel | ThermoFisher | 4252-0100 | |
| Needle 20 ga | Becton Dickinson (BD) | 305175 | |
| Parafilm M – Flexible film | Sigma-Aldrich | P7793-1EA | |
| Razor Blade | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Spatula | Cole-Parmer | EW-06369-18 | |
| Steriflip sterile filter | Fisher Scientific | SE1M179M6 | |
| Sucrose (Crystalline/Certified ACS) | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Syringe Pump | New Era Pump Systems Inc. | NE-1000 | |
| Thermo-Flask Benchtop Liquid Nitrogen Container | ThermoFisher | 2122 |
Riferimenti
- Carpentier, B., Gautier, A., Legallais, C. Artificial and bioartificial liver devices: present and future. Gut. 58 (12), 1690-1702 (2009).
- Fox, I. J., Chowdhury, J. R. Hepatocyte transplantation: Hepatocyte transplantation. American Journal of Transplantation. 4, 7-13 (2004).
- Hughes, R. D., Mitry, R. R., Dhawan, A. Current Status of Hepatocyte Transplantation. Transplantation. 93 (4), 342-347 (2012).
- Stéphenne, X., Najimi, M., Sokal, E. M. Hepatocyte cryopreservation: is it time to change the strategy. World Journal of Gastroenterology. 16 (1), 1-14 (2010).
- Terry, C., Dhawan, A., Mitry, R. R., Lehec, S. C., Hughes, R. D. Optimization of the cryopreservation and thawing protocol for human hepatocytes for use in cell transplantation. Liver Transplantation. 16 (2), 229-237 (2010).
- Pegg, D. E. Principles of cryopreservation. Methods in Molecular Biology. 368, 39 (2007).
- Baust, J. G., Gao, D., Baust, J. M. Cryopreservation: An emerging paradigm change. Organogenesis. 5 (3), 90-96 (2009).
- Hopkins, J. B., Badeau, R., Warkentin, M., Thorne, R. E. Effect of common cryoprotectants on critical warming rates and ice formation in aqueous solutions. Cryobiology. 65 (3), 169-178 (2012).
- Fahy, G. M., MacFarlane, D. R., Angell, C. A., Meryman, H. T. Vitrification as an approach to cryopreservation. Cryobiology. 21 (4), 407-426 (1984).
- Demirci, U., Montesano, G. Cell encapsulating droplet vitrification. Lab on a Chip. 7 (11), 1428 (2007).
- El Assal, R., et al. Bio-Inspired Cryo-Ink Preserves Red Blood Cell Phenotype and Function During Nanoliter Vitrification. Advanced Materials. 26 (33), 5815-5822 (2014).
- Dou, R., Saunders, R. E., Mohamet, L., Ward, C. M., Derby, B. High throughput cryopreservation of cells by rapid freezing of sub-μl drops using inkjet printing–cryoprinting. Lab on a Chip. 15 (17), 3503-3513 (2015).
- Samot, J., et al. Blood banking in living droplets. PloS One. 6 (3), 17530 (2011).
- Shi, M., et al. High-Throughput Non-Contact Vitrification of Cell-Laden Droplets Based on Cell Printing. Scientific Reports. 5 (1), (2016).
- de Vries, R. J., et al. Bulk Droplet Vitrification: An Approach to Improve Large-Scale Hepatocyte Cryopreservation Outcome. Langmuir. , (2019).
- Parmegiani, L., et al. Sterilization of liquid nitrogen with ultraviolet irradiation for safe vitrification of human oocytes or embryos. Fertility and Sterility. 94 (4), 1525-1528 (2010).
- Best, B. P. Cryoprotectant Toxicity: Facts, Issues, and Questions. Rejuvenation Research. 18 (5), 422-436 (2015).
