Ett protokoll för 3D-visualisering av mikroskopiska vävnads strukturer med hjälp av en röntgen-specifik färgningsmetod avsedd för röntgendatortomografi presenteras.
Vi visar en laboratoriebaserad metod som kombinerar röntgen-microCT och nanoCT med en specifik röntgen fläck, som riktar cellcytoplasman. Det beskrivna protokollet är lätt att applicera, snabbt och lämpligt för större mjukvävnads prov. Den presenterade metoden gör det möjligt att karakterisera viktiga vävnads strukturer i tre dimensioner och visas på en hel mus njure. Flerskalningsmetoden gör det möjligt att avbilda hela mus njure och stöder valet av ytterligare volymer av intresse, som förvärvas med högre upplösningar som sträcker sig in i nanometer Range. Därmed återges mjukvävnads morfologi med en liknande detaljnivå som motsvarande histologiska ljusmikroskopibilder. Djupare insikter i 3D-konfigurationen av vävnads strukturer uppnås utan att hindra ytterligare utredningar genom histologiska metoder.
Fullständig karakterisering av mjukvävnads preparat kräver information om 3D-vävnadens mikrostruktur. Den nuvarande guldmynt normen för mjukvävnads provanalyser är histopatologi. Den vävnad och cellulära morfologi av preparatet utforskas i 2D inom utvalda områden av intresse (ROIs) med hjälp av optisk mikroskopi1. Den här metoden har dock flera nackdelar. Beredningen av provet är tidskrävande, komplicerat, destruktivt och benägna att artefakter. De producerade mikroskopiska bilderna ger endast 2D-information parallellt med snittnings planet. Ofta begränsas numrera av histologiska delar upp, som undersöks, på grund av tid begränsningar2,3.
Under de senaste åren har området 3D-histologi utvecklats. Här är virtuella vävnads skivor från alla önskade rumsliga plan tillgängliga. Detta möjliggör spårning av strukturer i hela provet, vilket leder till en djupare förståelse av 3D vävnad arkitektur och strukturella förändringar i samband med olika patologier. Olika metoder har utvecklats för att uppnå generering av 3D-volymdata. De sträcker sig från seriell-avsnitt baserade metoder, som använder antingen ljus eller elektronmikroskopi4,5,6,7,8, att blockera-Face Imaging metoder, såsom episkopisk 3D-avbildning eller block-Face scanning elektronmikroskopi7,8,9. Alla nämnda metoder inbegriper dock antingen snittning eller förstörelse provet fullständigt, vilket inte medger ytterligare utredningar. Den erhållna upplösningen är mycket beroende av snittningsprocessen är benägna att artefakter som beskrivs i konventionell histologi. Dessa metoder lider också från justerings artefakter.
3D röntgenbild teknik såsom mikroskopisk och nanoskopisk datortomografi (microCT och nanoCT) strävar efter att generera 3D-högupplösta data utan förstörelse av vävnadsprovet. Hittills har den svaga röntgen dämpningen kontrasten i mjuk vävnad och den begränsade tillgången till höga upplösningar i en laboratoriemiljö minskat deras användning för 3D-visualisering av mikroskopiska vävnads strukturer. De senaste framstegen mot laboratoriebaserad, högupplöst röntgen CT möjliggör upplösningar långt under 1 μm10,11,12,13.
Bristen på kontrast i mjuk vävnad i konventionell dämpning-baserade röntgenbilder kompenseras av färgning agenter, som förbättrar röntgen dämpningen kontrast. Färgämnen som är kända från andra avbildningstekniker såsom osmium tetroxid (OSO4), jod kaliumjodid (IKI) eller fosfotungstic syra (PTA) används ofta14,15,16,17, 18,19,20,21,22,23,24,25. Färgämnen som möjliggör (i) specifik biologisk inriktning, (II) homogen och fullständig färgning, (III) enkel hantering, (IV) snabb inträngning av vävnaden utan att skapa artefakter som diffusions ringar, (v) stor och tät vävnads färgning, och (vi) Full kompatibilitet med histopatologi krävs för att etablera röntgen CT som verktyg för 3D-visualisering av mikroskopiska vävnads strukturer. I detta arbete visar vi hur mjukvävnads prov förbereds för röntgen-CT-avbildning med en cytoplasman-specifik röntgen fläck baserad på eosin som uppfyller de krav som anges ovan26.
Metoden med flerskalig avbildning säkerställer bedömningen av infärgnings kvaliteten genom en översikt över Mikroct-mätningar och urvalet av intresse volymer (VOIs) för ytterligare utredningar med hög upplösning. Färgning kvalitet analyseras med fokus på färgning parametrar såsom (i) fullständighet, (II) utseende diffusions ringar, (III) kontrastförbättring, (IV) utseende av CT artefakter såsom streck och (v) homogenitet. Den laboratoriebaserade nanoct-installationen, som använder geometrisk förstoring för att nå upplösningar ner till 100 nm, visualiserar mjukvävnads morfologi på (sub)-cellulär nivå10,27. En jämförande analys av Nanult skivor med motsvarande histologiska ljusmikroskopi bilder bekräftar reproduktion av vävnads arkitektur med liknande detalj på en mikroskopisk nivå i 2D, vilket möjliggör histopatologisk karakterisering av vävnaden Prov. Detta detaljerade video protokoll är avsett att öka medvetenheten och belysa potentialen hos denna metod som icke-förstörande 3D mjuk vävnad imaging verktyg är av intresse för ett brett vetenskapligt samhälle som zoologer, biologer och hälsa Yrkesverksamma.
För närvarande, eosin används som standard histologiskt protokoll för att märka cellens cytoplasma. Färgämnet appliceras som en 0,1% (w/v) vattenlösning på mikroskopiska skivor av mjuk vävnad (vanligtvis skuren med en tjocklek av 2-10 μm)33. Tillämpningen av denna standardiserade histologiska protokoll till 3D vävnadsprover såsom en hel mus njure inte resulterar i en dämpning kontrast förstärkt CT bild. Å ena sidan kan detta tillskrivas den låga inneboende dämpning egenskaper av mjuk vävnad för vanligtvis används röntgen energi av laboratoriebaserade microCT system. Vanligtvis är mjuk vävnad består av främst kol, väte, syre och kväve34, och därför inte leder till kontrastförbättring. Å andra sidan var den låga koncentrationen av eosin som användes för färgning den begränsande faktorn. Även om en eosin molekyl har fyra bromid atomer (hög atomnummer element bromin med Z = 3534), de känslighetsnivåer som krävs för röntgen CT Imaging var inte uppfyllda.
För att övervinna denna utmaning med låg dämpningen kontrast, flera koncentrationer av eosin undersöktes. En begränsning är här den maximala lösligheten av eosin i vatten, som är 30% (w/v) i en vattenlösning. Bästa dämpning kontrastförbättring inom mjuk vävnad observerades med den högsta eosin koncentrationen, som förväntades enligt Lambert-öllag. Därför genomfördes det slutliga Färgnings protokollet med den högsta koncentrationen.
Frågan hur man förbereder mjuk vävnad optimalt på molekylär nivå för färgning förfarande för att ytterligare förbättra kontrastförbättring besvarades av pH-justering. Här konstaterades försurning av mjukvävnads provet under fixering eller före färgning vara avgörande. Detta visades också av Hong et al.35. Den högre ackumuleringen av färgning agent inom cellens cytoplasma av syran uppnåddes genom förbättrade Joniska interaktioner, som var ett resultat av protonering av aminosyran sidokedjor av proteiner och peptider som finns inom cellens cytoplasma. Ett representativt resultat som belyser kontrast förbättringen jämfört med ett omålat mjukvävnads prov visas i figur 1a, b. Här, en strukturell översikt av en hel mus njure visualisera avgörande anatomiska regioner såsom cortex, medulla, papilla och njurbäckenet uppnåddes.
Det presenterade färg protokollet är enkelt att applicera och innehåller bara tre steg. De reagenser som krävs är lättillgängliga. Den totala infärgnings tiden på 24 timmar är snabb för en hel-organfärgning, vilket möjliggör 3D-visualisering av mjukvävnads prov (figur 1c, figur 2b och figur 4b) i laboratoriemiljö vid flera skalor ner till cellnivå. Det bör noteras att den totala infärgnings tiden och volymen av den infärgnings lösning som behövs kan begära vissa anpassningar beroende på typ av prov. Icke desto mindre lämpar sig eosinbaserade infärgnings protokollet för hel-organfärgning, som sedan möjliggör högupplöst Mikroct-avbildning av hela organ. Shrinkage artefakter på grund av lösningsmedels etanol, som användes för att hålla provet fuktigt under microCT mätningar, observerades inte. Ytterligare förberedelsesteg krävs för nanoCT Imaging, vilket möjliggör utredning av mindre Vävnadsdelar som hämtats från det ursprungliga provet. Med avseende på framtida histopatologiska tillämpningar kommer översikts skanningar att ge värdefulla insikter i förändrade anatomiska regioner och strukturer, vilket möjliggör bestämning av ROIs som visas i figur 2a. Dessa kan studeras i 3D av microCT (figur1c och figur 2b) eller nanult (figur 4b) och utvärderas i 2D med histologi (figur 3).
En annan styrka av protokollet ses i Full förenlighet med histopatologi med avseende på H & E färgning förfarande. Tillämpningen av det eosinbaserade infärgnings förfarandet på bulkprover hindrar inte ytterligare histologiska undersökningar (figur 3), även om den tillämpade eosinkoncentrationen är mycket högre jämfört med den histologiska infärgnings lösningen. Den nanult slice med en virtuell tjocklek på cirka 400 nm (figur 3a) jämför redan mycket väl med den histologiska avsnitt (figur 3c), som härrör från motsvarande mjuk vävnad provet. Med tanke på den ungefärliga tjockleken på en histologisk sektion med 7-10 μm, möjliggör generering av minimibildprojektions skivor av Nanult-data (figur 3b), som motsvarar en virtuell tjocklek av cirka 7 μm, för en bättre jämförelse med histologisk sektion (figur 3c). Här är cellkärnan tydligt avslöjas som icke-dämpande område som eosin specifikt fläckar proteiner och peptider i cellens cytoplasma33.
Tillämpningen av ytterligare motverka färgning med standard histologiska metoder är möjligt, även om ordningen på färgning jämfört med standard histologisk färgning förfarande var omvänd. Börjar först med den utvecklade eosin-baserade färgning protokoll för CT, följt av motverka färgning av de eosin-baserade histologiska avsnitt med hematoxylin, möjliggör full kompatibilitet och resulterar i en högkvalitativ färgning visar den förväntade formen av utseende. Cellen kärnor-specifik färgning med Mayers sura hematoxylin applicerades på den histologiska delen som belyser cellkärnan i lila (figur 3d). Tillämpningen av histologisk räknare färgning är för närvarande begränsad till H-fläcken. Andra standard histologiska Counter Infärgningar såsom periodiska acid Schiff bas, Elastica van Gieson eller Gomori silver måste utvärderas samt kompatibiliteten med immunohistokologiska tekniker måste testas.
Den eosin-baserade färgning protokollet möjliggör (i) cell cytoplasma-specifik inriktning, (II) homogen och fullständig färgning, (III) enkel implementering, (IV) snabb penetration av vävnaden utan att skapa artefakter såsom diffusions ringar, (v) färgning av stora och täta mjukvävnads prov, och vi) fullständig kompatibilitet med histopatologi med avseende på H & E-fläcken. Dessa krav är viktiga för att möjliggöra högupplöst röntgen CT visualisering av mjuk vävnad ner till cellnivå. I kombination med de nyligen utvecklade nanoct-apparaterna12,36,37, icke-förstörande generering av virtuella histologiska segment som är jämförbara i kontrast och upplösning till konventionella histologiska data är möjlig. Detta kombinerade tillvägagångssätt kommer att möjliggöra inrättandet av röntgen CT som ett värdefullt verktyg för 3D-visualisering av mikroskopiska vävnads strukturer.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Dr. Enken Drecoll för histologiska diskussioner och det oerhört hjälpsamma teamet på Excillum AB, Sverige. Vi erkänner finansiellt stöd genom DFG Cluster of Excellence München Center for Advanced Photonics (karta) och DFG Gottfried Wilhelm Leibniz program. Vidare har detta forskningsprojekt erhållit finansiering från Europeiska unionens Horisont 2020 forsknings-och innovationsprogram inom ramen för Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement No. HORISONT 2020-MSCA-IF-2015-703745-CONSALT.
50-ml centrifuge tube by Falcon | VWR | 734-0453 | |
Formaldehyde solution, 37% | Carl Roth | CP10.2 | acid-free, stabilized with ~10% MeOH |
Glacial acetic acid | Alfa Aesar | 36289.AP | |
Eosin Y disodium salt | Sigma-Aldrich | E4382 | certified by Biological Stain Commission |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Merck | L1825 | Dulbecco's formualtion, w/o calcium and magnesium |
Sample Tubes by Nalgene | Carl Roth | ATK5.1 | |
Rocking Shaker ST5 | CAT | 60281-0000 | |
Cellulose tissue paper | VWR | 115-0600 | |
Forceps, by USBECK Laborgeräte | VWR | 232-0096 | |
Microcentrifuge tubes by Eppendorf | VWR | 211-2120 | safe-lock, 2.0 ml |
Ethanol absolute by Baker Analyzed | VWR | 80252500 | |
Disposable safety scalpel by Aesculap | VWR | AESCBA210 | |
Petri dish by Sterilin | VWR | 391-2019 | |
Plastic pasteur pipette | Carl Roth | EA68.1 | graduated, 1 ml |
Desiccator by Duran | VWR | SCOT247826954 | |
Silicone grease by Bayer | Sigma-Aldrich | 85404 | high-vacuum |
Carbon dioxide cylinder with standpipe | Linde | 3700113 | 10 kg, short |
micro-porous treatment capsule | PLANO GmbH | 4614 | pore size 78 µm (B) |
Bal-Tec CPD 030 | Bal-Tec AG | CO2 as drying agent | |
Stemi 2000-C stereomicroscope with KL 1500 LCD | Zeiss | this stereomicroscope has been updated(1) | |
Zeiss Xradia Versa 500 | Zeiss | this microCT scanner has been updated(2) | |
Avizo Fire 8.1 | Thermo Fisher Scientific | ||
PILATUS detector as part of the nanoCT scanner | Dectris | single-photon counting detector(4,5); there are commercially availble nanoCT systems available (6,7) | |
nanofocus X-ray source as part of the nanoCT scanner | Excillum | high-flux nanofocus X-ray transmission tube(3); there are commercially availble nanoCT systems available(6,7) | |
(1) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS stereomicroscopes https://www.micro-shop.zeiss.com/de/de/system/Stereomikroskope/1006> (September 06, 2019). | |||
(2) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 510 Versa https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/zeiss-xradia-510-versa.html> (April 10, 2019). | |||
(3) Nachtrab, F. et al. Development of a Timepix based detector for the NanoXCT project. Journal of Instrumentation 10 (11), C11009, (2015). | |||
(4) Kraft, P. et al. Performance of single-photon-counting PILATUS detector modules. Journal of Synchrotron Radiation 16 (3), 368-375, (2009). | |||
(5) Kraft, P. et al. Characterization and calibration of PILATUS detectors. IEEE Transactions on Nuclear Science 56 (3), 758-764, (2009). | |||
(6) Germany, Z. ZEISS product information: ZEISS Xradia 810 Ultra https://www.zeiss.com/microscopy/int/products/x-ray-microscopy/xradia-810-ultra.html> (April 9 2019). | |||
(7) Company, G. E. GE product information: Phoenix nanotom m, https://www.gemeasurement.com/sites/gemc.dev/files/geit-31344en_nanotom_m_0517.pdf> (April 10, 2019). |