여기서, 우리는 시험관 내 유방동체재생정량분석법의 결과의 이행 및 해석을 설명한다.
유선은 여성의 수명 주기 에 걸쳐 대규모 호르몬 변화를 거치기 때문에 광범위한 재생 능력을 특징으로합니다. 유방 줄기 세포의 역할 (MaSCs) 널리 생리적 / 발달 맥락에서 유방 발암에 관해서 모두 연구된다. 이 양상에서, MaSC 속성에 초점을 맞춘 생체 내 연구는 매우 수요가 많다. 매머지피어 문화는 장기 형성의 대리를 나타내며 기본 및 번역 연구를 위한 귀중한 도구가 되었습니다. 여기서, 우리는 뮤린 1차 맘모스피어 배양및 MaSC 성장 특성의 정량화를 위한 상세한 프로토콜을 제시한다. 프로토콜은 유방 선 수집 및 소화, 1 차 유방 상피 세포의 격리 (MECs), 1 차 유방 골격 배양의 확립, 직렬 통과, 유방 골격 성장 매개 변수의 정량 및 결과의 해석을 포함한다. 예를 들어, 우리는 증가 자기 갱신 및 확산으로 이어지는 정상 MEC에 낮은 수준의 구성 Myc 표현의 효과를 제시한다.
유방 상피 줄기 및 전구 세포의 격리 및 시험관 내 배양은 유방 세포 생물학에 있는 그들의 속성을 이해하는 것이 필수적이 되었습니다. 우아한 계보 추적 및 연속 이식 은 그들의 생체 내 틈새 의 맥락에서 줄기 세포 (SCs) 및 기타 조직 하위 세트의 연구를 가능하게했다. 그러나, 이 접근법은 시간이 많이 걸리고 리포터 마우스 모델1,2,3,4,5의생성이 요구된다. 따라서, 시험관 내 배양 및 유방 줄기 세포 (MaSCs)의 전파는 주요 줄기 기능, 즉 자기 갱신 및 분화 능력을 아끼면서 현장에서 가장 큰 과제 중 하나입니다. 지난 몇 년 동안, 유방스피어 분석제는 정상 유방 조직 및 유방암 성장을 모델링하고, 정상 또는 암 SCs(CSC)를 정량화하고, 생체 내 문맥6,7,8,9,10,11에서그들의 활동의 대리 리포터로서 그들의 자기 갱신 능력을 평가하는 데 널리 사용되어 왔다.
유방 스피어 분석법은 효율적이고 비용 효율적인 접근법으로, 새로 분리된 유방 상피 세포(MECs)가 비부착 조건에서 배양되는 데, 이는 MaSCs만이 생존하고 현탁액에서 구를 형성하고 다른 모든 세포 유형은 anoikis에 의해 죽는다는 전제하에. 더욱이, 연속적인 비부착 구절에서 여러 세대의 맘모스피어를 형성하는 능력은 MaSCs6,9,11의자체 갱신 능력과 관련이 있다. 여기서, 우리는 처음에 Dontu 및 동료7에 의해 개발된 정량적 매머스피어 분석법의 상세한 프로토콜을 상세한 프로토콜로 설명하고, 선구적인 신경구분석법(12)의변형으로서, 적절한 성장 인자7,12의첨가와 함께 비부착, 무혈청 조건에서 가설성 SC의 성장을 가능하게 한다.
여기서, 우리는 시험관 내 의 MaSC 성장 특성의 정량적 설명에 대한 프로토콜을 설명한다. 일례로, 우리는 일반적인 뮤린 MaSCs에 낮은 수준의 구성 Myc 표현의 효과를 제시한다. 그러나 이 방법은 다양한 컨텍스트에 동일하게 적용할 수 있습니다. 인간 또는 뮤린 1차 세포는 확립된 세포주뿐만 아니라, 연속적으로 계류될 수 있는 유방구배양을 확립하기 위해 앵커리지 독립적인 조건에서 배양될 수 있다. 유전자 과발현 및 RNA 간섭은 제1 계의 말단에 바이러스 성 환전 단계를 첨가하여 프로토콜에 용이하게 도입될 수 있다(3.5단계 후). 양자택일로, 세포는 유착에서 감염되고 그 때 유방구로 도금될 수 있습니다.
여기에 제시된 분석의 중요한 양상은 시딩 셀 밀도이며, 이는 결과16,17의해석을 방해하는 응집체의 생성을 피할 수 있을 만큼 충분히 낮아야 한다. 매머지피어의 형태는 이러한 모호성을 해결하는 데 유익할 수 있습니다. 각 구절의 끝에 는 작고 둥근 구만 지정해야 합니다. 스페로이드의 원형과 크기를 모두 고려해야합니다. DIA의 자동화된 프로세스를 사용하여 이 단계는 객관적이고 절대적인 방식으로 적절한 임계값으로 보장됩니다. 종종, 선조는 유방 구수 에서 제외되어야 하는 세포의 acinar 구조물 또는 더 작은 군집을 형성할 것입니다. 엄지 손가락의 규칙으로, 우리는 100 μm 직경의 임계 값을 사용합니다. 마지막으로, 한 구절에서 다음 통로로 손상되지 않거나 완전히 해리되지 않은 유방이 옮겨지지 않도록주의해야합니다. 다른 한편으로는, 과잉 파이펫팅은 증가한 세포 죽음으로 이끌어 낼 것입니다. 따라서, 이러한 어려움이 발생하는 경우, 우리는 경미한 트립시네화 또는 Accutase 처리를 사용하고 단세포 현탁액의 생성을 보장하기 위해 40 μm 스트레이너를 통해 해리 된 구체를 전달하는 것이 좋습니다.
구체 형성 효율(SFE)은 유방스피어 배양에서 SC 또는 CSC 정량 ex vivo에 대한 대리로서 대안적으로 사용되어 왔다. SFE는 실제로 주어진 세포 집단에 있는 줄기 같이 세포의 측정입니다. 그러나 별개의 시점에서만 정보를 제공하기 때문에 덜 양심적인 접근 방식을 나타냅니다. 누적 구체 수와 누적 성장 곡선의 생성을 계산하면, 대신, 배양이 배출될 때까지 초기 세포 파종 단계로부터 배양배양물의 성장 속도를 추론하거나, 불멸의 배양의 경우, 원하는 수의 대구에 대해 유추할 수 있다. 성장 특성의 평가는 계수R2를 통해 지수 성장으로부터의 편차를 평가하고, 두 번째 단계에서, GR 값 자체의 평가를 허용한다.
중요하게도, 누적 매머스피어 성장 곡선은 CSC 레벨6,11에서소분자 억제제 또는 다른 화학치료제의 효과를 선택적으로 평가하는데 사용될 수 있다. 5-7 개의 구절에서 기능적으로 소모되는 일반적인 1 차 적인 유방구와는 달리, 종양 유방구는 무기한 확장하는 경향이 있습니다. 이 기능은 무제한 CSC 자체 갱신 기능에 연결되어 있습니다. 증식 및 CSC 자기 재생에 미치는 영향은 각각 종양 세포 및 유방구 성장 곡선의 생성을 통해 결합되지 않을 수 있다. CSC 특이적 효과는 누적 세포 성장속도6,11에영향을 미치거나 관계없이 누적 매머스피어 성장률의 감소를 초래할 것으로 예상된다.
마지막으로, 관심의 또 다른 영역은 성인 조직 SC 재프로그래밍중 하나입니다. 완전히 자란 유방구는 현상형 이질적인 세포 집단으로 구성되며, 이 때 단지 사소한 분획만이 생체 내에서 이식시 유방권 개시 능력 및 유방선 재생을 포함하는 줄기와 같은 특징을 유지한다6,9,11,18,19. 유방 전조기는 이렇게 확립된 표면 마커2,3을사용하여 시험관내 라벨 고정 검정6,9,11 또는, ex vivo를 사용하여 단리될 수 있다. 특히, 유방 선조는 anoikis를 살아남지 않으며 유방 구를 형성할 수 없습니다. 강제 Myc 발현은 PKHneg11로격리된 유방 선조에게 유방 전진기에게 유방 구개시 가능성을 부여하는 것으로 나타났으며, 그 결과 무기한으로 통과될 수 있는 배양물의 생성을 초래한다. 유사하게, 생리적 재프로그래밍의 음성 조절제의 간섭은 동일한 분석법을 사용하여 시험될 수 있다. 이 컨텍스트에서 발생할 수 있는 일반적인 문제는 제한된 수의 셀 입력입니다. 세포 입력이 10,000 셀보다 낮은 경우, 우리는 24 웰 플레이트 (최대 5,000 가능한 세포 / mL)에 시드하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고, 앵커리지 독립적인 문화 조건은 특히 재프로그래밍 효과가 즉각적이지 않은 경우 재프로그래밍 점수를 매기기에는 너무 가혹한 것으로 입증될 수 있습니다. 이러한 경우, 지지 매트릭스 및 3차원 오르노이드 배양물의 사용은20보다적절할 수 있다.
전반적으로, 유방구분석은 정상 및 종양 MEC 집단에서 줄기와 같은 성질을 채점하기 위해 쉽게 사용할 수 있는 비용 효율적인 옵션이다. 이 프로토콜에서 취해진 정량적 접근법은 상이한 조건에서 수행되거나 다양한 자극에 노출된 배양물 간의 비교를 용이하게 한다. 엄격하게 따를 때, 그것은 생체 내에서 줄기 특성을 정의하는 여러 선수의 분리를 허용하는 상대적으로 간단한 ex vivo 모델 시스템을 제공, 더 상세한 기계론 연구의 가능성을 제공.
The authors have nothing to disclose.
Rosa26-MycER 형질전환 마우스 모델의 친절한 선물에 브루노 아마티에게 감사드립니다. 이 작품은 WWCR, AIRC, ERC, 그리고 P.G.P. T.V. 및 X.A.에 대한 이탈리아 보건부의 보조금으로 FIRC및 A.S.의 FUV 보조금에 의해 지원되었습니다.
ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |