यहां, हम एक इन विट्रो मैमोस्फीयर आत्म-नवीकरण मात्रात्मक परख के परिणामों के कार्यान्वयन और व्याख्या का वर्णन करते हैं।
स्तन ग्रंथि व्यापक उत्थान क्षमता की विशेषता है, क्योंकि यह एक महिला के जीवन चक्र में बड़े पैमाने पर हार्मोनल परिवर्तन के माध्यम से चला जाता है । स्तन स्टेम कोशिकाओं (MaSCs) की भूमिका व्यापक रूप से दोनों शारीरिक/विकासात्मक संदर्भ में और स्तन कैंसरजन्य के संबंध में अध्ययन किया जाता है । इस पहलू में, एमएएससी गुणों पर केंद्रित पूर्व वीवो अध्ययन अत्यधिक मांग के बाद किए जाते हैं। मैमोस्फीयर संस्कृतियां अंग गठन के किराए का प्रतिनिधित्व करती हैं और बुनियादी और अनुवाददोनों अनुसंधान के लिए एक मूल्यवान उपकरण बन गई हैं। यहां, हम मूत्र प्राथमिक मैमोस्फीयर संस्कृतियों की पीढ़ी और MaSC विकास गुणों की मात्रा के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल पेश करते हैं। प्रोटोकॉल में मैमेरी ग्रंथि संग्रह और पाचन, प्राथमिक मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं (एमईसी) का अलगाव, प्राथमिक मैमोस्फीयर संस्कृतियों की स्थापना, धारावाहिक पासिंग, मैमोस्फीयर विकास मापदंडों की मात्रा और परिणामों की व्याख्या शामिल है। एक उदाहरण के रूप में, हम सामान्य एमसीसी पर निम्न स्तर की संविलियन Myc अभिव्यक्ति के प्रभाव को प्रस्तुत करते हैं जिससे आत्म-नवीकरण और प्रसार में वृद्धि होती है ।
मैममैरी सेल जीव विज्ञान में उनके गुणों को समझने के लिए अलगाव और मैममैरी एपिथेलियल स्टेम और प्रोजेनिटर कोशिकाओं की इन विट्रो संस्कृति आवश्यक हो गई है। सुरुचिपूर्ण वंश अनुरेखण और धारावाहिक प्रत्यारोपण परखों ने वीवो आला में उनके संदर्भ में स्टेम सेल (एससी) और अन्य ऊतक सबसेट के अध्ययन को सक्षम किया है। हालांकि, यह दृष्टिकोण समय लेने वाला है और इसके लिए रिपोर्टर माउस मॉडल1,2,3,4,5की पीढ़ी की आवश्यकता होती है। इसलिए, इन विट्रो संस्कृति और मैमेरी स्टेम सेल (MaSCs) के प्रचार, जबकि प्रमुख स्टेमनेस सुविधाओं, अर्थात् आत्म नवीकरण और भेदभाव की क्षमता बख्शते, क्षेत्र में सबसे बड़ी चुनौतियों में से एक है । पिछले वर्षों में, मैमोस्फीयर परख का व्यापक रूप से सामान्य स्तन ऊतक और स्तन कैंसर के विकास को मॉडल करने के लिए उपयोग किया गया है, सामान्य या कैंसर एससी (सीएससी) की मात्रा निर्धारित करने और वीवो संदर्भ6,7,8, 9,10,11में अपनी गतिविधि के सरोगेट रिपोर्टर के रूप में उनकी आत्म-नवीकरण क्षमता का आकलन करने के लिए।
मैमोस्फीयर परख एक कुशल और लागत प्रभावी दृष्टिकोण है, जिसमें हौसले से अलग-थलग मैममैरी एपिथेलियल कोशिकाओं (एमईसी) को गैर-अनुयायी परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जाता है, इस आधार के साथ कि केवल मैट्रिक्स जीवित रहेंगे और निलंबन में क्षेत्र बनाएंगे जबकि अन्य सभी सेल प्रकार एनोइकिस द्वारा मर जाएंगे। इसके अलावा, धारावाहिक गैर-अनुयायी मार्ग में मैमोस्फीयर की कई पीढ़ियों को बनाने की क्षमता एमएएससी6,9,11की आत्म-नवीकरण क्षमता से संबंधित है। यहां, हम एक मात्रात्मक मैमोस्फीयर परख के एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जिसे शुरू में डोन्टू औरसहयोगियों द्वारा अग्रणी न्यूरोस्फीयर परख12के संशोधन के रूप में विकसित किया गया था, जो उचित विकास कारकों7,12के अलावा गैर-अनुयायी, सीरम-मुक्त स्थितियों में ख्यात अनुसूचित जाति के विकास को सक्षम करता है।
यहां, हम विट्रो में MaSC विकास गुणों के मात्रात्मक विवरण के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। एक उदाहरण के रूप में, हम सामान्य मूत्र मैट्रिक्स पर निम्न स्तर के संविलियन Myc अभिव्यक्ति के प्रभाव को प्रस्तुत करते हैं। हालांकि, इस दृष्टिकोण को विभिन्न संदर्भों पर समान रूप से लागू किया जा सकता है । मानव या मूत्र प्राथमिक कोशिकाओं, साथ ही स्थापित सेल लाइनों, मैमोस्फीयर संस्कृतियों है कि क्रमिक रूप से पारित किया जा सकता है स्थापित करने के लिए स्वतंत्र परिस्थितियों में सुसंस्कृत किया जा सकता है । जीन अतिअभिव्यक्ति और आरएनए हस्तक्षेप आसानी से पहले मार्ग के अंत में एक वायरल ट्रांसड्यूक्शन कदम के अलावा (चरण ३.५ के बाद) के साथ प्रोटोकॉल में पेश किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, कोशिकाओं को आसंजन में संक्रमित किया जा सकता है और फिर मैमोस्फीयर के रूप में चढ़ाया जा सकता है।
यहां प्रस्तुत परख का एक महत्वपूर्ण पहलू सीडिंग सेल घनत्व है, जो16,17के परिणामों की व्याख्या में हस्तक्षेप करने वाले समग्र ों की पीढ़ी से बचने के लिए पर्याप्त कम होना चाहिए। इस अस्पष्टता को हल करने के लिए मैमोस्फीयर की आकृति विज्ञान जानकारीपूर्ण हो सकती है। प्रत्येक मार्ग के अंत में केवल कॉम्पैक्ट, गोल क्षेत्रों की गणना की जानी चाहिए। स्फेरॉइड और आकार दोनों की परिपत्रता को ध्यान में रखा जाना चाहिए। डीआईए की स्वचालित प्रक्रिया का उपयोग करके, यह कदम उचित थ्रेसहोल्ड के साथ एक उद्देश्य और पूर्ण तरीके से सुनिश्चित किया जाता है। अक्सर, जनक एसीनार संरचनाएं या कोशिकाओं के छोटे समूह बनाएंगे जिन्हें मैमोस्फीयर की गिनती से बाहर रखा जाना चाहिए। अंगूठे के नियम के रूप में, हम 100 माइक्रोन व्यास की सीमा का उपयोग करते हैं। अंत में, एक मार्ग से अगले तक अक्षुण्ण या गैर-पूरी तरह से विसोसिएट मैमोप्सेरे के हस्तांतरण से बचने के लिए सावधानी बरती जानी चाहिए। दूसरी ओर, अतिरिक्त पाइपिंग से सेल डेथ बढ़ जाएगी। इस प्रकार, यदि ऐसी कठिनाइयों का सामना करना पड़ता है, तो हम हल्के ट्राइप्सिनाइजेशन या एक्यूटेज उपचार का उपयोग करने और एकल-कोशिका निलंबन की पीढ़ी सुनिश्चित करने के लिए 40 माइक्रोन छलनी के माध्यम से विसोशिएट क्षेत्रों को पारित करने की सलाह देते हैं।
मैमोस्फीयर संस्कृतियों में एससी या सीएससी क्वांटेशन पूर्व वीवो के लिए सरोगेट के रूप में, क्षेत्र बनाने दक्षता (SFE) का वैकल्पिक रूप से उपयोग किया गया है। SFE वास्तव में एक दिए गए सेल आबादी में स्टेम की तरह कोशिकाओं का एक उपाय है । हालांकि, यह एक कम कर्तव्यनिष्ठ दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है क्योंकि यह केवल अलग समय बिंदुओं पर जानकारी प्रदान करता है। संचयी क्षेत्र संख्या ओं की गणना और संचयी विकास घटता की पीढ़ी, इसके बजाय, प्रारंभिक सेल सीडिंग चरण से संस्कृति की विकास दर के अनुमान को सक्षम बनाती है जब तक कि संस्कृति निकास या अमर संस्कृतियों के मामले में, मार्ग की वांछित संख्या के लिए। विकास गुणों का मूल्यांकन गुणांक आर2 के माध्यम से घातीय वृद्धि से विचलन के मूल्यांकन की अनुमति देता है और, दूसरे चरण में, जीआर मूल्य का मूल्यांकन ही।
महत्वपूर्ण बात यह है कि सीएससी स्तर6,11पर छोटे अणु अवरोधकों या अन्य कीमोथेरेपी दवाओं के प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए संचयी मैमोस्फीयर वृद्धि घटता का उपयोग किया जा सकता है। सामान्य प्राथमिक मैमोस्फीयर के विपरीत, जो कार्यात्मक रूप से 5-7 मार्ग में निकास करते हैं, ट्यूमर मैमोस्फीयर अनिश्चित काल तक विस्तार करते हैं। यह फीचर अनलिमिटेड सीएससी सेल्फ रिन्यूअल एबिलिटी से जुड़ा हुआ है। प्रसार और सीएससी आत्म नवीकरण पर प्रभाव क्रमशः ट्यूमर सेल और मैमोस्फीयर विकास घटता की पीढ़ी के माध्यम से अयुग्मित किया जा सकता है । सीएससी-विशिष्ट प्रभाव के परिणामस्वरूप संचयी मैमोस्फीयर वृद्धि दर में कमी आने की संभावना है, जो संचयी कोशिका वृद्धि दर6,11पर प्रभाव के साथ या बिना प्रभाव के है ।
अंत में, ब्याज का एक और क्षेत्र वयस्क ऊतक अनुसूचित जाति पुनर्प्रोग्रामिंग में से एक है। पूरी तरह से विकसित मैमोस्फीयर में एक फेनोआमतौर पर विषम कोशिका आबादी होती है, जिसमें केवल एक छोटा सा अंश स्टेम जैसी विशेषताओं को बरकरार रखता है, जिसमें मैमोस्फीयर-शुरू करने की क्षमता और वीवो6,9,11,18,19में प्रत्यारोपण पर मैममैरी ग्रंथि उत्थान शामिल है। मैमेरी प्रोजेनिटर्स को स्थापित सतह मार्कर2,3का उपयोग करके या तो इन विट्रो लेबल-रिटेनिंग परख6,9,11 या, पूर्व वीवो का उपयोग करके अलग-थलग किया जा सकता है। विशेष रूप से, मैममैरी जनक एनोइकिस जीवित नहीं रहते हैं और मैमोस्फीयर बनाने में असमर्थ होते हैं। लागू Myc अभिव्यक्ति को PKHneg11के रूप में अलग मैममैरी जनक ों को मैमोस्फीयर दीक्षा क्षमता प्रदान करने के लिए दिखाया गया है, जिसके परिणामस्वरूप एक संस्कृति की पीढ़ी है जिसे अनिश्चित काल के लिए पारित किया जा सकता है। इसी तरह, एक ही परख का उपयोग करके शारीरिक पुनर्प्रोग्रामिंग के नकारात्मक नियामकों के हस्तक्षेप का परीक्षण किया जा सकता है। इस संदर्भ में, एक आम मुद्दा जो उत्पन्न हो सकता है वह है सेल इनपुट की सीमित संख्या। यदि सेल इनपुट 10,000 कोशिकाओं से कम है, तो हम 24-अच्छी प्लेटों (अधिकतम 5,000 व्यवहार्य कोशिकाओं/mL) में सीडिंग की सलाह देते हैं। फिर भी, एंकोरेज स्वतंत्र संस्कृति की स्थिति को पुनर्प्रोग्रामिंग स्कोरिंग के लिए बहुत कठोर साबित किया जा सकता है, खासकर उन मामलों में जहां रीप्रोग्रामिंग प्रभाव तत्काल नहीं है। ऐसे मामलों में, सहायक मैट्रिक्स और 3-आयामी ऑर्गेनोइड संस्कृतियों का उपयोग20अधिक उपयुक्त हो सकता है।
कुल मिलाकर, मैमोस्फीयर परख एक लागत प्रभावी विकल्प है जिसे सामान्य और ट्यूमर एमईसी आबादी में स्टेम जैसे गुणों को स्कोरिंग के लिए आसानी से नियोजित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल में लिया गया मात्रात्मक दृष्टिकोण विभिन्न परिस्थितियों में किए गए संस्कृतियों के बीच तुलना की सुविधा प्रदान करता है या विविध उत्तेजनाओं के संपर्क में आता है। जब कड़ाई से पीछा किया जाता है, तो यह एक अपेक्षाकृत सरल पूर्व वीवो मॉडल प्रणाली प्रदान करता है जो कई खिलाड़ियों को अनयुग्मन की अनुमति देता है जो वीवो में स्टेम गुणों को परिभाषित करते हैं, जो अधिक विस्तृत मशीनिस्ट अध्ययन की संभावना प्रदान करते हैं।
The authors have nothing to disclose.
हम Rosa26-MycER ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के तरह उपहार के लिए ब्रूनो अमती शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को WWCR, AIRC, ईआरसी, और इटली के स्वास्थ्य मंत्रालय से P.G.P. T.V. और X.A. से अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था FIRC और एएस द्वारा एक FUV अनुदान द्वारा समर्थित थे ।
ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |