Här beskriver vi genomförandet och tolkningen av resultaten av en in vitro-mammosfär självförnyelse kvantitativ analys.
Bröstkörteln kännetecknas av omfattande regenereringskapacitet, eftersom det går igenom massiva hormonella förändringar under hela livscykeln för en hona. Rollen av bröst stamceller (MaSCs) är allmänt studeras både i fysiologiska/utvecklingsmässiga sammanhang och när det gäller bröstcancerogenesen. I denna aspekt, ex vivo studier fokuserade på MaSC egenskaper är mycket eftertraktade. Mammosphere kulturer utgör ett surrogat av orgel formation och har blivit ett värdefullt verktyg för både grundläggande och translationell forskning. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för generering av murina primära mammosphere kulturer och kvantifiering av MaSC tillväxt egenskaper. Protokollet innehåller bröstkörtel insamling och matsmältning, isolering av primära bröst epitelceller (mecs), etablering av primära mammosfär kulturer, seriell passaging, kvantifiering av tillväxt parametrar för mammosphere och tolkning av resultaten. Som ett exempel presenterar vi effekten av låg nivå konstitutiva MYC uttryck på normal MECs leder till ökad självförnyelse och spridning.
Isolering och in vitro-kultur av bröstepitelial stam och stamceller har blivit avgörande för att förstå deras egenskaper i bröst cellbiologi. Elegant linje spårning och seriell transplantation analyser har möjliggjort studiet av stamceller (SCs) och andra vävnad undergrupper i samband med deras in vivo nisch. Men detta tillvägagångssätt är tidskrävande och kräver generering av reporter musmodeller1,2,3,4,5. Därför är in vitro-kultur och förökning av bröst stamceller (MaSCs) medan sparande viktiga stemness funktioner, nämligen självförnyelse och differentiering förmåga, en av de största utmaningarna på området. Under de senaste åren, mammosphere analysen har använts i stor utsträckning för att modellera både normal mjölk vävnad och bröstcancer tillväxt, att kvantifiera normal eller cancer SCs (CSCS) och bedöma deras självförnyelse förmåga som en surrogat reporter för sin verksamhet i sina respektive in vivo sammanhang6,7,8,9,10,11.
Den mammosphere analysen är en effektiv och kostnadseffektiv strategi, där nyligen isolerade bröst epitelceller (MECs) odlas i icke-anhängare villkor, med förutsättningen att endast MaSCs kommer att överleva och bildar sfärer i fjädring medan alla andra celltyper kommer att dö av Anoikis. Dessutom är förmågan att bilda flera generationer av mammosfärer i seriella icke-adherent passager relaterade till självförnyelse förmåga MASCS6,9,11. Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för en kvantitativ mammosphere-analys, som ursprungligen utvecklades av dontu och kollegor7 som en modifiering av den banbrytande neurosphere-analysen12, vilket möjliggjorde tillväxt av förmodade SCs i icke-adherenta, serum fria förhållanden med tillägg av lämpliga tillväxtfaktorer7,12.
Här beskriver vi ett protokoll för kvantitativ beskrivning av MaSC Growth Properties in vitro. Som ett exempel presenterar vi effekten av låg nivå konstitutiva MYC uttryck på normala murina MaSCs. Detta tillvägagångssätt kan dock tillämpas lika på olika sammanhang. Mänskliga eller murina primära celler, samt etablerade cellinjer, kan odlas i Anchorage oberoende villkor för att etablera mammosphere kulturer som kan seriellt passaged. Genöveruttryck och RNA-interferens kan lätt införas i protokollet med tillägg av en viral signaltransduktion steg i slutet av den första passagen (efter steg 3,5). Alternativt kan celler smittas i vidhäftning och sedan pläteras som mammosfärer.
En kritisk aspekt av analysen som presenteras här är sådd CELLTÄTHETEN, som bör vara tillräckligt låg för att undvika generering av aggregat stör tolkningen av resultaten16,17. Morfologin av mammosfärerna kan vara informativ för att lösa denna tvetydighet. Endast kompakta, runda sfärer bör räknas upp i slutet av varje passage. Både cirkularitet av spheroids och storleken bör beaktas. Genom att använda den automatiserade processen i DIA, säkerställs detta steg med lämpliga tröskelvärden på ett objektivt och absolut sätt. Ofta, progenitorer kommer att bilda acinar strukturer eller mindre kluster av celler som bör uteslutas från mammosfär räknas. Som tumregel använder vi ett tröskelvärde på 100 μm diameter. Slutligen, försiktighet bör iakttas för att undvika överföring av intakt eller icke-helt dissocierade mammopsheres från en passage till nästa. Å andra sidan kommer överpipettering leda till ökad celldöd. Således, om sådana svårigheter påträffas, rekommenderar vi att du använder mild trypsinization eller Accutase behandling och passerar dissocierade sfärer genom en 40 μm sil för att säkerställa generering av encelliga suspensioner.
Sfär formnings effektivitet (SFE) har använts alternativt, som ett surrogat för SC eller CSC kvantifiering ex vivo i mammosphere kulturer. SFE är verkligen ett mått på stamliknande celler i en viss cellpopulation. Det är dock ett mindre samvetsgrant förhållningssätt eftersom det ger information endast vid olika tidpunkter. Beräkningen av kumulativa sfär nummer och generering av kumulativa tillväxtkurvor, i stället möjliggör inferens av tillväxttakten i kulturen från den initiala cellen sådd steg tills kulturen avgassystem eller, i fråga om förevigade kulturer, för det önskade antalet passager. Bedömningen av tillväxt egenskaper gör det möjligt att utvärdera avvikelsen från den exponentiella tillväxten genom koefficienten R2 och, i ett andra steg, bedömningen av gr-värdet i sig.
Viktigt, kumulativa mammosphere tillväxtkurvor kan användas för att utvärdera effekten av små molekyler hämmare eller andra kemoterapeutiska läkemedel selektivt på CSC nivå6,11. I motsats till normala primära mammospheres, som funktionellt avgassystem i 5-7 passager, tumör mammospheres tenderar att expandera på obestämd tid. Den här funktionen är länkad till den obegränsade CSC-självförnyelse förmågan. Effekterna på proliferation och CSC självförnyelse kan kopplas bort genom generering av tumör cell och mammosfär tillväxtkurvor, respektive. En CSC-specifik effekt förväntas resultera i en minskning av den kumulativa mammosfärens tillväxttakt, med eller utan effekt på den kumulativa celltillväxt takten6,11.
Slutligen, ett annat område av intresse är en av vuxen vävnad SC omprogrammering. Fullvuxna mammosfärer består av en fenotypisk heterogena cellpopulation, där endast en mindre fraktion behåller Stem-liknande funktioner, inklusive mammosfär-initierande förmåga och bröstkörtel förnyelse vid transplantation in vivo6,9,11,18,19. Bröstprogenitorer kan således isoleras antingen med hjälp av in vitro-etikett-behållande analyser6,9,11 eller, ex vivo, med hjälp av fastställda ytmarkörer2,3. Särskilt, bröst föregångare överlever inte Anoikis och är oförmögna att bilda mammosfärer. Påtvingad MYC uttryck har visat sig ge mammosphere initiering potential att bröst-stamceller isolerade som pkhneg11, vilket resulterar i generering av en kultur som kan blint på obestämd tid. Likaså kan interferens av negativa regulatorer av fysiologiska omprogrammering testas med samma analys. I detta sammanhang är ett vanligt problem som kan uppstå det begränsade antalet cellinmatning. Om cell ingången är lägre än 10 000 celler, rekommenderar vi sådd i 24-brunn plattor (maximalt 5 000 livskraftiga celler/mL). Icke desto mindre kan förankrings oberoende odlingsförhållanden bevisas vara för hårda för att göra en omprogrammering, särskilt i de fall då omprogrammeringen inte är omedelbar. I sådana fall kan användningen av en stödjande matris och 3-dimensionella Organoid kulturer vara lämpligare20.
Sammantaget är mammosphere-analysen ett kostnadseffektivt alternativ som lätt kan användas för att poänggöra stamliknande egenskaper i normala och tumoraliska MEC-populationer. Det kvantitativa tillvägagångssättet i detta protokoll underlättar jämförelser mellan kulturer som utförs under olika förhållanden eller utsätts för olika stimuli. När den följs rigoröst, det ger en relativt enkel ex vivo modellsystem som tillåter avkoppling av flera aktörer som definierar Stem egenskaper in vivo, erbjuder möjlighet till mer detaljerade mekanistiska studier.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Bruno Amati för den vänliga gåvan av Rosa26-MycER transgena musmodell. Detta arbete finansierades av bidrag från WWCR, AIRC, ERC, och det italienska hälsoministeriet till P.G.P. T.V. och X.A. stöddes av FIRC och A.S. av en FUV Grant.
ACK lysis buffer | Lonza | 10-548E | Ammonium-chloride-potassium lysis bufer, 100 mL. |
B27 | Invitrogen | 17504-044 | B27 supplement 50X (10 mL). Final concentration 2% v/v. |
bFGF | Peprotech | 100-18B | Human recombinant fibroblast growth factor – basic, 50 μg. Stock solution 100 μg/μL in Tris 5 mM pH 7.6. Final dilution 0.02% v/v. |
Collagenase | Sigma | C2674 | Collagenase from Clostridium histolyticum. Type I-A, lyophilized powder, 1 g. Stock 20,000 U/mL in DMEM. Final dilution 1% v/v. |
DMEM | Lonza | 12-614F | Dulbecco's modified Eagle's medium |
DPBS | Microgem | S17859L0615 | Dulbecco's phosphate buffered saline |
EGF | Tebu-Bio | AF-100-15 | Recombinant human epithelial growth factor. Stock solution 100 μg/mL in sterile dH2O. Final dilution 0.02% v/v. |
Glutamine | Lonza | 17-605E | L-Glutamine, 200 mM. Final dilution 1% v/v. |
Heparin | PharmaTex | 34692032 | Stock concentration 5,000 IU/mL. Final dilution 0.008% v/v. |
Hyaluronidase | Sigma | H4272 | Type IV-S, powder, 750-3,000 U/mg solid, 30 mg. Stock solution 10 mg/mL in sterile dH2O. Final dilution 1% v/v. |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | Stock concentration 100 μg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Insulin | SAFCBiosciences | 91077C | Insulin, human recombinant, dry powder, 250 mg. Stock concentration 1 mg/mL. Final dilution 0.5% v/v. |
Low attachment 6-well plates | Corning | 351146 | Sterile 6-well not treated cell culture plates with clear flat bottom and lid. |
MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary epithelial cell growth basal medium |
Penicllin-Streptomycin mixture | Lonza | 17-602F | Contains 10,000 U potassium penicillin and 10,000 µg streptomycin sulfate per mL in 0.85% saline. Final dilution 1% v/v. |
Poly-HEMA | Sigma | P3932 | Dissolve in 95% EtOH overnight at 55 °C. Stock concentration 12% w/v. Final dilution 1% v/v in 95% EtOH. Filter (0.22 μm) before use. |