Bakteriell peptid display for valg av Novel Biotinylating enzymer
Summary
Her presenterer vi en metode for å velge for romanen varianter av E. coli biotin-protein ligase BirA som biotinylates et bestemt mål peptid. Protokollen beskriver byggingen av en plasmider for bakteriell visning av målet peptid, generering av en BirA bibliotek, utvalg og karakterisering av BirA varianter.
Abstract
Biotin er en attraktiv post-translational modifikasjon av proteiner som gir en kraftig kode for isolering og påvisning av protein. Enzymatisk biotinylation av E. coli biotin-protein ligase BirA er svært spesifikk og gir mulighet for biotinylation av mål proteiner i sitt eget miljø; men den nåværende bruken av BirA mediert biotinylation krever tilstedeværelsen av en syntetisk Acceptor peptid (AP) i mål proteinet. Derfor er dens anvendelse begrenset til proteiner som er konstruert for å inneholde AP. Formålet med denne protokollen er å bruke bakteriell visning av et peptid avledet fra en uendret mål protein å velge for BirA varianter som biotinylates peptid. Systemet er basert på en enkelt plasmider som gjør det mulig for co-uttrykk for BirA varianter sammen med et stillas for peptid displayet på bakteriell overflate. Protokollen beskriver en detaljert prosedyre for inkorporering av målet peptid i displayet stillaset, etablering av BirA biblioteket, utvalg av aktive BirA varianter og første karakterisering av de isolerte BirA varianter. Metoden gir et svært effektivt valg system for isolering av romanen BirA varianter som kan brukes for videre rettet utviklingen av biotin-protein ligases som biotinylate et innfødt protein i komplekse løsninger.
Introduction
Biotinylation av et protein skaper en kraftig kode for sin affinitet isolasjon og deteksjon. Enzymatisk protein biotinylation er en svært spesifikk post-translational modifikasjon katalysert av biotin-protein ligases. E. coli biotin-protein ligase BirA er ekstremt spesifikk og covalently biotinylates bare et begrenset antall naturlig forekommende proteiner på bestemte lysin rester1. Fordelene med BirA katalysert biotinylation er for tiden utnyttet ved å smelte målet protein med en liten syntetisk 15-amino-acid biotin Acceptor peptid (AP) som er effektivt biotinylated2 og gir mulighet for svært spesifikke og effektiv in vivo og in vitro biotinylation av co-Expression eller tillegg av BirA3,4,5. Selv om i vivo og in vitro BirA katalysert biotin-protein ligation er en attraktiv merkings strategi, er dens anvendelse begrenset til prøver som inneholder AP-smeltet proteiner. Formålet med denne metoden er utviklingen av nye mutanter av biotin-protein ligases som selektivt biotinylate innfødte uendrede proteiner, og dermed utvide antall søknader der enzymatisk biotinylation strategien kan brukes.
Protein funksjon kan utvikles gjennom gjentakende runder av genet mutasjon, utvalg, og forsterkning av genet varianter med ønsket funksjon. En sterk og effektiv utvalgs strategi er avgjørende for den regissert evolusjon og biotin-protein ligase aktivitet er lett valgt på grunn av den sterke bindingen mellom biotin og streptavidin og dens homologs6. Phage display Technologies tillater valg av phages som viser biotinylated peptider7,8. Siden forsterkning av isolerte phages krever infeksjon av en bakteriell vert, men phage utvalg med streptavidin skaper en flaskehals ved at høy affinitet binding av biotin til streptavidin er nærmest irreversible under ikke-denaturering Forhold. For å sikre reversibel binding av biotinylated phages, monomere avidins med lavere affinitet ble brukt som resulterte i en beskjeden ~ 10-fold berikelse7. Vi har nylig utviklet en bakteriell visningsmetode for isolering av romanen BirA varianter som eliminerer behovet for eluering fra affinitet matrise og dermed fjerner en flaskehals fra tidligere BirA utvalg systemer9. Faktisk gir våre bakterielle display systemet for en > 1, 000, 000-fold berikelse av aktive kloner i et enkelt utvalg trinn9, og dermed gi en effektiv utvalg system for regissert utviklingen av romanen BirA varianter.
Vår bakterielle display system består av to komponenter, BirA med en C-terminal 6xHis Tag og et stillas protein som gjør det mulig for overflaten visning av et mål peptid. Vi brukte stillaset protein forbedret sirkulært permuted ytre membran protein X (eCPX) siden effektiv visning av peptider kan observeres på både N-og C-Termini10,11. Fusjonen av målet peptid sekvensen til C-Terminus av eCPX sikrer biotinylation av bakterier uttrykker aktive BirA varianter. Bakteriene gir mulighet for effektiv streptavidin utvalg som biotinylated peptid nå vises på overflaten (figur 1a).
Hensikten med denne metoden er å velge for romanen varianter av BirA som biotinylates peptid sekvenser til stede i innfødte proteiner. Systemet er kodet av gener som finnes på plasmider pBAD-BirA-eCPX-AP, som inneholder en arabinose-induserbart promoter kontrollerende BirA (araBAD), og en T7 promoter kontrollerende eCPX9 (figur 1b). Den nåværende protokollen beskriver detaljert prosedyre for 1) innlemmelse av et peptid avledet fra et mål protein i C-terminal av eCPX, 2) etablering av et mutational bibliotek av BirA av feil utsatt PCR, 3) utvalg av streptavidin magnetisk-aktivert celle sortering (Mac), 4) kvantifisering av bakterier berikelse, og 5) første karakterisering av isolerte kloner.
Protocol
Representative Results
Discussion
Som for alle utvalgsmetoder, er stringens av vaske trinnene av største betydning. Siden bakterier ikke trenger å bli eluert fra perlene før forsterkning av de utvalgte kloner, kan den høye affinitet binding mellom biotin og streptavidin brukes i stedet for å bruke lavere affinitet avidins, som tidligere gjort med phage display system, for utvalget av BirA varianter7,8. Dette sikrer at sjeldne kloner er valgt og at ikke-biotinylated bakterier blir forkastet. …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne takker Mohamed Abdullahi Ahmed for eksperten tekniker assistanse. Dette arbeidet ble støttet av stipend fra Lundbeck Foundation, Novo nordisk Foundation, den danske nyre foreningen, Aase og Ejnar Danielsen Foundation, A.P. Møller Foundation for fremming av medisinsk vitenskap, og Knud og Edith Eriksen Memorial Foundation.
Materials
| 10% precast polyacrylamide gel | Bio-Rad | 4561033 | |
| Ampicilin | Sigma-Aldrich | A1593 | |
| ApE – A plasmid editor v2.0 | NA | NA | downloaded from http://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ |
| Arabinose | Sigma-Aldrich | A3256 | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DPBS (10X), no calcium, no magnesium | ThermoFischer Scientific | 14200083 | |
| DpnI restriction enzyme | New England BioLabs | R0176 | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | ThermoFischer Scientific | 65001 | |
| GenElute Plasmid Miniprep Kit | Sigma-Aldrich | PLN350 | |
| GeneMorph II EZClone Domain Mutagensis kit | Agilent Technologies | 200552 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G5516 | |
| Immobilon-P PVDF Membrane | Millipore | IPVH15150 | |
| IPTG | Sigma-Aldrich | I6758 | |
| LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| NEB 5-alpha Competent E. coli | New England BioLabs | C2987 | |
| NuPAGE LDS Sample Buffer (4X) | ThermoFischer Scientific | NP0007 | |
| NuPAGE Sample Reducing Agent (10X) | ThermoFischer Scientific | NP0009 | |
| pBAD-BirA-eCPX-AP | Addgene | 121907 | Used a template and positive control |
| pBAD-BirA-eCPX-AP(K10A) | Addgene | 121908 | negative control |
| Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | New England BioLabs | M0491 | For insertion of peptide sequence in pBAD-BirA-eCPX-AP, any high fidelity polymerase will do |
| QuadroMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| Skim Milk Powder | Sigma-Aldrich | 70166 | |
| Streptavidin-HRP | Agilent Technologies | P0397 | |
| T7 Express lysY/Iq Competent E. coli | New England BioLabs | C3013 | |
| Tryptone | Millipore | T9410 | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
| Western Lightning Plus-ECL | PerkinElmer | NEL103001EA | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1625 |
Riferimenti
- Polyak, S. W., Abell, A. D., Wilce, M. C. J., Zhang, L., Booker, G. W. Structure, function and selective inhibition of bacterial acetyl-CoA carboxylase. Applied Microbiology and Biotechnology. 93 (3), 983-992 (2011).
- Schatz, P. J. Use of Peptide Libraries to Map the Substrate Specificity of a Peptide-Modifying Enzyme: A 13 Residue Consensus Peptide Specifies Biotinylation in Escherichia coli. Nature Biotechnology. 11 (10), 1138-1143 (1993).
- de Boer, E., Rodriguez, P., et al. Efficient biotinylation and single-step purification of tagged transcription factors in mammalian cells and transgenic mice. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (13), 7480-7485 (2003).
- Tannous, B. A., Grimm, J., Perry, K. F., Chen, J. W., Weissleder, R., Breakefield, X. O. Metabolic biotinylation of cell surface receptors for in vivo imaging. Nature Methods. 3 (5), 391-396 (2006).
- Howarth, M., Takao, K., Hayashi, Y., Ting, A. Y. Targeting quantum dots to surface proteins in living cells with biotin ligase. Proceedings of the National Academy of Sciences. 102 (21), 7583-7588 (2005).
- Michael Green, N. Avidin and streptavidin. Avidin-Biotin Technology. 184, 51-67 (1990).
- Fujita, S., Taki, T., Taira, K. Selection of an Active Enzyme by Phage Display on the Basis of the Enzyme’s Catalytic Activity in vivo. ChemBioChem. 6 (2), 315-321 (2005).
- Iwamoto, M., Taki, T., Fujita, S. Selection of a biotin protein ligase by phage display using a combination of in vitro selection and in vivo enzymatic activity. Journal of Bioscience and Bioengineering. 107 (3), 230-234 (2009).
- Granhøj, J., Dimke, H., Svenningsen, P. A bacterial display system for effective selection of protein-biotin ligase BirA variants with novel peptide specificity. Scientific Reports. 9 (1), 4118 (2019).
- Rice, J. J. Bacterial display using circularly permuted outer membrane protein OmpX yields high affinity peptide ligands. Protein Science. 15 (4), 825-836 (2006).
- Rice, J. J., Daugherty, P. S. Directed evolution of a biterminal bacterial display scaffold enhances the display of diverse peptides. Protein Engineering Design and Selection. 21 (7), 435-442 (2008).
- Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences. BioTechniques. 28, 1102-1104 (2000).
