Overvågning af ekstracellulære pH-pc'er i Biofilm på tværs af kongeriget ved hjælp af konfokalmikroskopi
Summary
Protokollen beskriver dyrkning af biofilm på tværs af kongeriget bestående af Candida albicans og Streptococcus mutans og præsenterer en konfokalmikroskopibaseret metode til overvågning af ekstracellulær pH inde i disse biofilm.
Abstract
Biofilm på tværs af kongeriget, der består af både svampe- og bakterieceller, er involveret i en række orale sygdomme, såsom endodontiske infektioner, parodontitis, slimhindeinfektioner og især tidlige barndomscaries. Under alle disse betingelser påvirker pH i biofilmmatrixen mikrober-vært interaktioner og dermed sygdomsprogression. Denne protokol beskriver en konfokal mikroskopibaseret metode til overvågning af pH-dynamikken i biofilm på tværs af kongeriget, der omfatter Candida albicans og Streptococcus mutans. Den pH-afhængige dual-emission spektrum og farvning egenskaber ratiometric sonde C-SNARF-4 udnyttes til at bestemme dråber i pH i ekstracellulære områder af biofilm. Brug af pH-ratiometri med sonden kræver et omhyggeligt udvalg af billeddannelsesparametre, en grundig kalibrering af farvestoffet og omhyggelig, tærskelbaseret efterbehandling af billeddataene. Når teknikken anvendes korrekt, giver den mulighed for hurtig vurdering af ekstracellulær pH i forskellige områder af en biofilm og dermed overvågning af både vandrette og lodrette pH-gradienter over tid. Mens brugen af konfokalmikroskopi begrænser Z-profilering til tynde biofilm på 75 μm eller derunder, er brugen af pH-ratiometri ideel til noninvasive undersøgelse af en vigtig virulensfaktor i biofilm på tværs af kongeriget.
Introduction
Biofilm på tværs af kongeriget, der omfatter både svampe- og bakteriearter, er involveret i flere patologiske tilstande i mundhulen. Candida spp. er ofte blevet isoleret fra endodontiske infektioner1 og fra parodontale læsioner2,3. I slimhindeinfektioner, streptokok arter fra mitis gruppen har vist sig at øge svampebiofilm dannelse, væv invasion, og formidling i både in vitro og murine modeller4,5,6,7. Mest interessant, oral transport af Candida spp. har vist sig at være forbundet med forekomsten af caries hos børn8. Som vist i gnaver modeller, en symbiotisk forhold mellem Streptococcus mutans og Candidas albicans øger produktionen af ekstracellulære polysaccharider og fører til dannelsen af tykkere og mere kariogene biofilm9,10.
I alle ovennævnte betingelser, især førskolekarier, er biofilmpH af betydning for sygdomsprogression, og biofilmmatrixens fremtrædende rolle for udviklingen af acidogene mikromiljøer11 kræver metoder, der gør det muligt at studere pH-ændringer i biofilm på tværs af kongeriget. Enkle og præcise konfokale mikroskopibaserede tilgange til at overvåge pH inde i bakterie12 og svampe13 biofilm er blevet udviklet. Med ratiometrisk farvestof C-SNARF-4 og tærskel-baseret billede efterbehandling, ekstracellulære pH kan bestemmes i realtid i alle tre dimensioner af en biofilm14. Sammenlignet med andre offentliggjorte teknikker til mikroskopibaseret pH-monitorering i biofilm er pH-ratiometri med C-SNARF-4 enkel og billig, fordi det ikke kræver syntese af partikler eller forbindelser, der omfatter et referencefarvestof15 eller brug af to-foton excitation16. Brugen af blot ét farvestof forhindrer problemer med sondeopdeling, fluorescerende udblødning og selektiv blegning16,17,18, mens der stadig er mulighed for en pålidelig differentiering mellem intra- og ekstracellulær pH. Endelig, inkubation med farvestoffet udføres efter biofilm vækst, som gør det muligt at studere både laboratorium og in situ-dyrkede biofilm.
Formålet med dette arbejde er at udvide anvendelsen af pH-ratiometri og tilvejebringe en metode til undersøgelse af pH-ændringer i biofilm på tværs af kongeriget. Som proof of concept anvendes metoden til at overvåge pH i bifilm af to arter bestående af S. mutans og C. albicaner, der udsættes for glukose.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der ertidligerebeskrevet forskellige protokoller for dyrkning af biofilm på tværs af kongeriget C. albicans og Streptococcus spp. Men den nuværende opsætning fokuserer på enkle vækstbetingelser, en tidsplan forenelig med regelmæssige arbejdsdage, en afbalanceret artssammensætning og udviklingen af en voluminøs biofilmmatrix….
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anette Aakjær Thomsen og Javier E. Garcia er anerkendt for fremragende teknisk support. Forfatterne takker Rubens Spin-Neto for frugtbare diskussioner om billedanalyse.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
Riferimenti
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).
