Monitoraggio del pH extracellulare nei biofilm tra regni incrociati utilizzando la microscopia Confocal
Summary
Il protocollo descrive la coltivazione di biofilm tra regni costituiti da albicani Candida e Streptococcus mutans e presenta un metodo confocale basato sulla microscopia per il monitoraggio del pH extracellulare all’interno di questi biofilm.
Abstract
I biofilm tra regni composti da cellule fungine e batteriche sono coinvolti in una varietà di malattie orali, come infezioni endodontiche, parodontite, infezioni mucosali e, in particolare, carie della prima infanzia. In tutte queste condizioni, il pH nella matrice del biofilm influisce sulle interazioni microbo-ospite e quindi sulla progressione della malattia. Il presente protocollo descrive un metodo confocale basato sulla microscopia per monitorare le dinamiche del pH all’interno di biofilm tra regni incrociati che comprendono albicani Candida e mutans Streptococcus. Lo spettro a doppia emissione dipendente dal pH e le proprietà di colorazione della sonda ratiometrica C-SNARF-4 sono sfruttati per determinare le gocce di pH nelle aree extracellulari dei biofilm. L’uso di pH ratiometry con la sonda richiede una scelta meticolosa di parametri di imaging, una calibrazione completa del colorante e un’attenta post-elaborazione basata sulla soglia dei dati dell’immagine. Se utilizzata correttamente, la tecnica consente la valutazione rapida del pH extracellulare in diverse aree di un biofilm e quindi il monitoraggio dei gradienti di pH orizzontali e verticali nel tempo. Mentre l’uso di limiti di microscopia confocale per biofilm sottili di 75 m o meno, l’uso di pH ratiometry è ideale per lo studio non invasivo di un importante fattore di virulenza nei biofilm cross-kingdom.
Introduction
I biofilm tra regni incrociati che comprendono specie sia fungine che batteriche sono coinvolti in diverse condizioni patologiche nella cavità orale. Candida spp. sono stati spesso isolati da infezioni endodontiche1 e da lesioni parodontali2,3. Nelle infezioni mucosali, specie streptococcal del gruppo mitis hanno dimostrato di migliorare la formazione di biofilm fungini, l’invasione dei tessuti e la diffusione in entrambi i modelli in vitro e murini4,5,6,7. La cosa più interessante, il trasporto orale di Candida spp. è stato dimostrato di essere associato con la prevalenza di carie nei bambini8. Come mostrato nei modelli di roditori, una relazione simbiotica tra Streptococcus mutans e Candidas albicans aumenta la produzione di polisaccharides extracellulari e porta alla formazione di biofilm biogenici più spessi e cariogenici9,10.
In tutte le condizioni di cui sopra, in particolare le carie della prima infanzia, il pH del biofilm è importante per la progressione della malattia e il ruolo eminente della matrice dei biofilm per lo sviluppo di microambienti acidogenici11 richiede metodologie che consentano di studiare i cambiamenti del pH all’interno di biofilm tra regni incrociati. Sono stati sviluppati approcci confocali a base di microscopia confocale semplici e accurati per monitorare il pH all’interno di biofilm batterici12 e13 fungini. Con il colorante ratiometrico C-SNARF-4 e la post-elaborazione dell’immagine basata sulla soglia, il pH extracellulare può essere determinato in tempo reale in tutte e tre le dimensioni di un biofilm14. Rispetto ad altre tecniche pubblicate per il monitoraggio del pH basato sulla microscopia nei biofilm, la pH ratiometry con C-SNARF-4 è semplice ed economica, perché non richiede la sintesi di particelle o composti che includono un colorante di riferimento15 o l’uso di eccitazione a due fotoni16. L’uso di un solo colorante previene problemi con la compartimentazione della sonda, il sanguinamento fluorescente e lo sbiancamento selettivo16,17,18 pur consentendo una differenziazione affidabile tra pH intra ed extracellulare. Infine, l’incubazione con il colorante viene eseguita dopo la crescita del biofilm, che consente di studiare sia i biofilm di laboratorio che quelli coltivati in situ.
L’obiettivo del presente lavoro è quello di estendere l’uso della pH ratiometry e fornire un metodo per studiare i cambiamenti di pH nei biofilm tra regni. Come prova di concetto, il metodo viene utilizzato per monitorare il pH in biofilm a doppia specie costituiti da S. mutans e C. albicans esposti al glucosio.
Protocol
Representative Results
Discussion
Diversi protocolli per la coltivazione di biofilm tra regni che coinvolgono C. albicans e Streptococcus spp. sono stati descritti in precedenza9,22,23,24,25. Tuttavia, l’attuale configurazione si concentra su condizioni di crescita semplici, un calendario compatibile con i normali giorni lavorativi, una composizione equilibrata delle…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Anette Aakjar Thomsen e Javier E. Garcia sono riconosciute per un eccellente supporto tecnico. Gli autori ringraziano Rubens Spin-Neto per fruttuose discussioni sull’analisi delle immagini.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
Riferimenti
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