공초점 현미경을 사용하여 크로스 킹덤 생물막에서 세포 외 pH 모니터링
Summary
이 프로토콜은 칸디다 알비칸스와 연쇄상 구균 뮤탄으로 구성된 크로스 킹킹 바이오필름의 재배를 설명하고 이러한 생물막 내부의 세포외 pH 모니터링을 위한 공초점 현미경 기반 방법을 제시한다.
Abstract
곰팡이 와 세균성 세포로 구성된 크로스 킹덤 생물막은 엔도돈증 감염, 치주염, 점막 감염 및 특히 어린 시절 충치와 같은 다양한 구강 질환에 관여합니다. 이러한 모든 조건에서, 생물막 매트릭스내의 pH는 미생물-숙주 상호작용 및 따라서 질병 진행에 영향을 미친다. 본 프로토콜은 칸디다 알비칸스 및 연쇄상 구균 뮤탄을 포함하는 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 역학을 모니터링하는 공초점 현미경 기반 방법을 기술한다. pH 의존적 이중 방출 스펙트럼 및 비메트릭 프로브 C-SNARF-4의 염색 특성은 생물막의 세포외 영역에서 pH의 하락을 결정하기 위해 이용된다. 프로브와 pH 비율 측정을 사용하려면 이미징 매개 변수의 세심한 선택, 염료의 철저한 교정, 이미지 데이터의 신중한 임계값 기반 사후 처리가 필요합니다. 올바르게 사용될 때, 기술은 생물막의 다른 지역에 있는 세포외 pH의 급속한 평가를 허용하고 따라서 시간 지남에 따라 수평 및 수직 pH 구배 둘 다의 감시를 허용합니다. 공초점 현미경 검사법의 사용은 Z 프로파일링을 75 μm 이하의 얇은 바이오필름으로 제한하지만, pH 비율 측정법의 사용은 왕국 간 생물막에서 중요한 독성 계수의 비침습적 연구에 이상적입니다.
Introduction
곰팡이와 세균성 종을 모두 포함하는 크로스 킹덤 생물막은 구강내 여러 병리학 적 조건에 관여합니다. 칸디다 spp. 빈번 하 게 에서 분리 된 endodontic 감염1 그리고 치 주 변 병 변에서2,3. 점막 감염에서, 기염 단에서 연쇄상 구균 종은 시험관 내 및 murine 모형4,5,6,7둘 다에 있는 곰팡이 생물막 대형, 조직 침략 및 보급을 강화하기 위하여 보였습니다. 가장 흥미롭게도, 칸디다 종의 구강 마차는어린이8에서 우식증의 보급과 관련이 있는 것으로 입증되었습니다. 설치류 모델에서 도시된 바와 같이, 연쇄상 구균 뮤탄스와 칸디다스 알비칸스 사이의 공생 관계는 세포외 다당류의 생산을 증가시키고 더 두껍고 더 많은 카리오제닉 생물막의 형성을 이끈다,10.
위에서 언급한 모든 조건에서, 특히, 생물막 pH는 질병 진행에 매우 중요하며, 산성미세환경(11)의 개발을 위한 생물막 매트릭스의 탁월한 역할은 크로스 킹덤 생물막 내부의 pH 변화를 연구할 수 있는 방법론을 요구한다. 세균12 및 곰팡이13 생물막 내부의 pH를 모니터링하는 간단하고 정확한 공초점 현미경 기반 접근법이 개발되었습니다. 비측정 염료 C-SNARF-4 및 임계값 기반 이미지 후처리를 통해, 세포외 pH는생물막(14)의모든 3차원에서 실시간으로 결정될 수 있다. 생물막에서 현미경 기반 pH 모니터링을 위한 다른 공표된 기술에 비해, C-SNARF-4를 사용한 pH 비측정법은 기준염료(15) 또는 2광자인용(16)의사용을 포함하는 입자 또는 화합물의 합성을 필요로 하지 않기 때문에 간단하고 저렴하다. 단 하나의 염료를 사용하면 프로브 구획화, 형광 피,선택적 표백16,17,18의 문제를 방지하면서 세포 내 pH와 세포 외 pH 간의 신뢰할 수있는 분화를 허용합니다. 마지막으로, 염료를 가진 배양은 실험실과 그(것)들 성장한 생물막에서 둘 다 공부하는 것을 허용하는 생물막 성장 후에 행해줍니다.
본 연구의 목적은 pH 비측정법의 사용을 확장하고 왕국 간 생물막에서 pH 변화를 연구하는 방법을 제공하는 것이다. 개념의 증거로서, 이 방법은 포도당에 노출된 S. 뮤탄및 C. 알비칸스로 구성된 이중 종 생물막에서 pH를 모니터링하는 데 사용된다.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. 알비칸스 및 연쇄상 구균 spp를 포함하는 크로스 킹클크로스 킹에 대한 상이한 프로토콜은 이전에9,22,23,24,25를기술되었다. 그러나, 현재설정은 단순 성장 조건, 정규 근무일과 호환되는 시간 일정, 균형 잡힌 종 조성 및 방대한 생물막 매트릭스 의 개발?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
아네트 아크예르 톰슨과 하비에르 E. 가르시아는 뛰어난 기술 지원을 인정받고 있습니다. 저자는 이미지 분석에 대한 유익한 토론에 대한 루벤스 스핀 네토 감사.
Materials
| Blood agar plates | Statens Serum Institut | 677 | |
| Brain heart infusion | Oxoid | CM1135 | |
| Brain heart infusion + 5 % sucrose | BDH laboratory supplies | 10274 | |
| Candida albicans | National Collection of Pathogenic Fungi | NCPF 3179 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| daime: digital image analysis in microbial ecology | Universität Wien | N/A | Freeware; V2.1; https://dome.csb.univie.ac.at/daime |
| Dimethyl sulfoxide | Life Technologies | D12345 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life technologies | 10270 | |
| GS-6R refrigerated centrifuge | Beckman | N/A | |
| ImageJ | National Institutes of Health | N/A | Freeware; V1.46r; https://imagej.nih.gov/ij |
| Java | Oracle | N/A | Freeware necessary to run ImageJ; V8.0; https://java.com/en/download |
| µ-Plate 96 Well Black | Ibidi | 89626 | |
| MyCurveFit | MyAssays Ltd. | N/A | |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) buffer | Bioworld | 700728 | |
| PHM210 pH-meter | Radiometer Analytical | ||
| Plan-Apochromat 63x oil immersion objective | Zeiss | N/A | NA=1.4 |
| SNARF®-4F 5-(and-6)-Carboxylic Acid | Life Technologies | S23920 | |
| Sterile physiological saline | VWR | 6404 | |
| Streptococcus mutans | Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen | DSM 20523 | |
| Vis-spectrophotometer V-3000PC | VWR | N/A | |
| XL Incubator | PeCON | N/A | |
| Zeiss LSM 510 META | Zeiss | N/A |
Riferimenti
- Siqueira, J. F., Sen, B. H. Fungi in endodontic infections. Oral Surgery, Oral Medicine, Oral Pathology, Oral Radiology, and Endodontics. 97 (5), 632-641 (2004).
- Matic Petrovic, S., et al. Subgingival areas as potential reservoirs of different Candida spp in type 2 diabetes patients and healthy subjects. PloS One. 14 (1), 0210527 (2019).
- De-La-Torre, J., et al. Oral Candida colonization in patients with chronic periodontitis. Is there any relationship. Revista Iberoamericana De Micologia. 35 (3), 134-139 (2018).
- Xu, H., et al. Streptococcal co-infection augments Candida pathogenicity by amplifying the mucosal inflammatory response. Cellular Microbiology. 16 (2), 214-231 (2014).
- Xu, H., Sobue, T., Bertolini, M., Thompson, A., Dongari-Bagtzoglou, A. Streptococcus oralis and Candida albicans Synergistically Activate μ-Calpain to Degrade E-cadherin From Oral Epithelial Junctions. The Journal of Infectious Diseases. 214 (6), 925-934 (2016).
- Dongari-Bagtzoglou, A., Kashleva, H., Dwivedi, P., Diaz, P., Vasilakos, J. Characterization of mucosal Candida albicans biofilms. PloS One. 4 (11), 7967 (2009).
- Diaz, P. I., et al. Synergistic interaction between Candida albicans and commensal oral streptococci in a novel in vitro mucosal model. Infection and Immunity. 80 (2), 620-632 (2012).
- Xiao, J., et al. Candida albicans and Early Childhood Caries: A Systematic Review and Meta-Analysis. Caries Research. 52 (1-2), 102-112 (2018).
- Falsetta, M. L., et al. Symbiotic relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans synergizes virulence of plaque biofilms in vivo. Infection and Immunity. 82 (5), 1968-1981 (2014).
- Hwang, G., et al. Candida albicans mannans mediate Streptococcus mutans exoenzyme GtfB binding to modulate cross-kingdom biofilm development in vivo. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006407 (2017).
- Koo, H., Falsetta, M. L., Klein, M. I. The exopolysaccharide matrix: a virulence determinant of cariogenic biofilm. Journal of Dental Research. 92 (12), 1065-1073 (2013).
- Schlafer, S., Dige, I. Ratiometric Imaging of Extracellular pH in Dental Biofilms. Journal of Visualized Experiments. (109), 53622 (2016).
- Schlafer, S., Kamp, A., Garcia, J. E. A confocal microscopy-based method to monitor extracellular pH in fungal biofilms. FEMS Yeast Research. 18 (5), (2018).
- Schlafer, S., Bælum, V., Dige, I. Improved pH-ratiometry for the three-dimensional mapping of pH microenvironments in biofilms under flow conditions. Journal of Microbiological Methods. 152, 194-200 (2018).
- Hidalgo, G., et al. Functional tomographic fluorescence imaging of pH microenvironments in microbial biofilms by use of silica nanoparticle sensors. Applied and Environmental Microbiology. 75 (23), 7426-7435 (2009).
- Vroom, J. M., et al. Depth Penetration and Detection of pH Gradients in Biofilms by Two-Photon Excitation Microscopy. Applied and Environmental Microbiology. 65, 3502-3511 (1999).
- Lawrence, J. R., Swerhone, G. D. W., Kuhlicke, U., Neu, T. R. In situ evidence for metabolic and chemical microdomains in the structured polymer matrix of bacterial microcolonies. FEMS Microbiology Ecology. 92 (11), (2016).
- Franks, A. E., et al. Novel strategy for three-dimensional real-time imaging of microbial fuel cell communities: monitoring the inhibitory effects of proton accumulation within the anode biofilm. Energy Environmental Science. 2 (1), 113-119 (2009).
- de Jong, M. H., van der Hoeven, J. S., van OS, J. H., Olijve, J. H. Growth of oral Streptococcus species and Actinomyces viscosus in human saliva. Applied and Environmental Microbiology. 47 (5), 901-904 (1984).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Daims, H., Lücker, S., Wagner, M. Daime, a novel image analysis program for microbial ecology and biofilm research. Environmental Microbiology. 8 (2), 200-213 (2006).
- Barbosa, J. O., et al. Streptococcus mutans Can Modulate Biofilm Formation and Attenuate the Virulence of Candida albicans. PloS One. 11 (3), 0150457 (2016).
- Thein, Z. M., Samaranayake, Y. H., Samaranayake, L. P. Effect of oral bacteria on growth and survival of Candida albicans biofilms. Archives of Oral Biology. 51 (8), 672-680 (2006).
- Krzyściak, W., et al. Effect of a Lactobacillus Salivarius Probiotic on a Double-Species Streptococcus Mutans and Candida Albicans Caries Biofilm. Nutrients. 9 (11), 1242 (2017).
- Liu, S., et al. Nicotine Enhances Interspecies Relationship between Streptococcus mutans and Candida albicans. BioMed Research International. 2017, 7953920 (2017).
- Schlafer, S., Meyer, R. L. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix. Journal of Microbiological Methods. 138, 50-59 (2017).
- Schlafer, S., et al. Ratiometric imaging of extracellular pH in bacterial biofilms with C-SNARF-4. Applied and Environmental Microbiology. 81 (4), 1267-1273 (2015).
- Ohle, C., et al. Real-time microsensor measurement of local metabolic activities in ex vivo dental biofilms exposed to sucrose and treated with chlorhexidine. Applied and Environmental Microbiology. 76 (7), 2326-2334 (2010).
- Schlafer, S., et al. pH landscapes in a novel five-species model of early dental biofilm. PloS One. 6 (9), 25299 (2011).
- Divaris, K., et al. The Supragingival Biofilm in Early Childhood Caries: Clinical and Laboratory Protocols and Bioinformatics Pipelines Supporting Metagenomics, Metatranscriptomics, and Metabolomics Studies of the Oral Microbiome. Methods in Molecular Biology. 1922, 525-548 (2019).
- Stewart, P. S. Mini review: convection around biofilms. Biofouling. 28 (2), 187-198 (2012).
- Stoodley, P. Biofilms: Flow disrupts communication. Nature Microbiology. 1, 15012 (2016).
