يقدم هنا بروتوكول لإثراء الخلايا المنوية البشيتين، الحيوانات المنوية المستديرة، والحيوانات المنوية ممدود من الخصيتين الماوس الكبار باستخدام التدرج كثافة الزلال المصل البقري متقطع مع معدات المختبر القياسية.
لتوصيف كل خطوة من خطوات تكوين الحيوانات المنوية، يجب على الباحثين فصل التجمعات الفرعية المختلفة للخلايا الجرثومية عن الخصيتين. ومع ذلك، عزل مجموعات منفصلة أمر صعب، لأن الخصية الكبار يحتوي على مزيج معقد من الخلايا الجرثومية من جميع خطوات تكوين الحيوانات المنوية جنبا إلى جنب مع مجموعات معينة من الخلايا الجسدية. على مدى العقود القليلة الماضية، تم تطبيق تقنيات مختلفة مثل تمرة الطرد المركزي، وفرز الخلايا المنشطة الفلورية (FACS)، وSTA-PUT بنجاح لعزل الخلايا الجرثومية. والعيب هو أنها جميعا تتطلب أجهزة مخصصة والتدريب المتخصص. وفقا للمبادئ التي تقوم عليها طريقة STA-PUT، تم وضع بروتوكول بسيط لعزل الخلايا المنوية البشيكيتين، والحيوانات المنوية المستديرة، والحيوانات المنوية ممدود من الخصيتين الماوس. بعد إعداد تعليق خلية واحدة من الخلايا الخصية، يتم إثراء مجموعات خلايا محددة عن طريق ترسيب الجاذبية من خلال تدرج كثافة الزلال المصل البقري المستمر (BSA). ثم يتم جمع كسور الخلية يدويا وتحليلها مجهريًا. ويمكن تطبيق هذا التدرج الكثافة المعدلة لبروتوكول ترسب الحيوانات المنوية المستديرة (MDR) على نطاق واسع، لأنه لا يتطلب سوى معدات مختبرية قياسية. وعلاوة على ذلك، يتطلب البروتوكول الحد الأدنى من مواد البدء، مما يقلل من تكلفته واستخدام الحيوانات المختبرية.
لا يزال الكثير غير معروف عن الأحداث الجزيئية والبيولوجية التي تحدث خلال تكوين الحيوانات المنوية الثدييات، وهي عملية معقدة تتحول فيها الخلايا الجذعية المنوية إلى الحيوانات المنوية المتخصصة للغاية1،2. يحدث تكوين الحيوانات المنوية داخل الأنابيب المنوية للالخصية. تحتوي الأنابيب على خليط من الخلايا الجرثومية من كل خطوة من خطوات التمايز، بما في ذلك الخلايا الجذعية المنوية، وتقسيم الحيوانات المنوية من الناحية الميتوتيكية، والحيوانات المنوية الميوسيتية، والحيوانات المنوية postmeiotic (التي تخضع للتمايز الهابلويد من الجولة الحيوانات المنوية إلى الحيوانات المنوية ممدود، وأخيرا إلى الحيوانات المنوية ناضجة). وتشمل الخلايا الجسدية للالخصية الخلايا السرتولية التي تختلط مع الخلايا الجرثومية داخل الأنابيب شبه الصنوبرية، والخلايا المائية حول الأنابيب التي تشكل جدران الأنابيب، وخلايا Leydig المنتجة لهرمون تستوستيرون في الفضاء الخلالي بين الأنابيب.
دراسة العمليات الجزيئية والكيميائية الحيوية أثناء تكوين الحيوانات المنوية غالبا ً ما يتطلب فصل مجموعات الخلايا الجرثومية المتميزة عن خليط معقد من خلايا الخصية. وقد وضعت العديد من الاستراتيجيات المختلفة لإثراء الخلايا. الأساليب الأكثر نجاحا هي STA-PUT سرعة الترسيب بواسطة وحدة الجاذبية3،4،5،6،الطرد المركزي elutriation على أساس الطرد المركزي المضادةللتدفق 7،8، وفرز الخلايا المنشطة بالفلورة (FACS) الذي يفصل الخلايا وفقًا لمحتوى الحمض النووي و/أو علامات محددة. وتستخدم هذه الأساليب عادة بين الباحثين الحيوانات المنوية وتسمح لإثراء فعال لأنواع محددة من الخلايا الجرثومية. ومع ذلك، فإن الحد من هذه التقنيات هو أنها تتطلب معدات متخصصة ومكلفة تتطلب الخبرة.
يقدم هنا بروتوكول بسيط وغير مكلفة لعزل السكان المخصب من ثلاثة مجموعات الخلايا الأكثر وفرة من الخصيتين الماوس: الحيوانات المنوية المستديرة، والحيوانات المنوية pachytene، والحيوانات المنوية ممدود. ويشار إلى هذا البروتوكول باسم تدرج الكثافة المعدلة للنطافة المستديرة (MDR)، لأنه يعمل بشكل جيد بشكل خاص لإثراء الحيوانات المنوية المستديرة. وتستند طريقة MDR إلى نفس المبادئ التي تستند إليها الترسيب السريع STA-PUT، ومع ذلك فهي لا تتطلب سوى معدات مختبر ية قياسية. يسمح للخلايا الحية بالرواسب من خلال تدرج كثافة الزلال المصل البقري (BSA) المعد يدويًا داخل أنبوب قياسي بمساحة 50 مل تحت مجال الجاذبية في الأرض. تتحرك الخلايا الأكبر بشكل أسرع من خلال التدرج، الذي يفصل بين مجموعات مختلفة من الخلايا الجرثومية. بعد الترسيب، يتم جمع الكسور المخصب من أنواع الخلايا الثلاثة يدوياً. ونقاء هذه التجمعات من الخلايا الغنية مماثل لتلك التي حصلت عليها STA-PUT وelutriation الطرد المركزي.
وبالإضافة إلى تغطية بناء واستخدام تدرج BSA للترسب السريع، يصف البروتوكول أيضًا طريقة الهضم لإطلاق خلايا الخصية من الأنابيب شبه الصنوبرية. تم تعديل البروتوكول من تلك التي وضعتها Romrell وآخرونوآخرون 9 ويشمل الهضم المتسلسل مع الكولاجين الرابع وتريبسين. وقد ثبت الهضم المتسلسل جنبا إلى جنب مع استخدام العازلة بيكربونات (أي حل كريبس) لتعزيز كبير في فصل وصلاحية الخلايا الجرثومية9.
أثناء إثراء MDR، تنفق الخلايا حوالي 4 ساعة معًا خارج بيئة الأنابيب شبه الصنوبرية ولا تخضع للقوى الميكانيكية المجهدة، مما يسمح بجمع كسور خلوية قابلة للحياة للغاية لتحليل المصب. وبالإضافة إلى ذلك، فإن بروتوكول MDR، على غرار التلهون الطرد المركزي وSTA-PUT، لا يتطلب أي معالجة كيميائية أو وسم للخلايا، مما يساعد أيضاً على الحفاظ على صلاحيتها. الأهم من ذلك، أقل قدر اثنين من الخصيتين الماوس الكبار كافية لعزل MDR، وبالتالي، يوفر ماوس واحد الكبار ما يكفي من الخلايا المخصبلكل من الحمض النووي الريبي وتحليل البروتين. معيار STA-PUT بروتوكول يوصي باستخدام ما يصل إلى 12 الفئران الكبار لعزل الخلية6; على الرغم من أنه، استناداً إلى الخبرة السابقة، فمن المعروف أن العزلة الناجحة يمكن أن يتم من ثلاثة إلى أربعة فئران بالغة. أقل كمية من المواد الأولية التي أبلغ عن أنها كافية لelutriation الطرد المركزي هو ستة الخصية الماوس (ثلاثة فئران)8. ولذلك، وإلى جانب القضاء على الحاجة إلى معدات متخصصة باهظة الثمن، فإن بروتوكول MDR يقلل من عدد الحيوانات المختبرية المطلوبة.
يقدم هنا بروتوكول بسيط وغير مكلف لعزل السكان المخصب من الحيوانات المنوية المستديرة، والحيوانات المنوية البشيكية، والحيوانات المنوية ممدود باستخدام معدات المختبر القياسية (نظرة عامة على البروتوكول المبين في الشكل 4). على الرغم من عدم الحاجة إلى الخبرة أو الآلات باهظة الثمن، هناك بعض الخطوات الحاسمة التي يجب النظر فيها أثناء هضم الأنسجة، وبناء التدرج، وتحميل تعليق الخلية على التدرج.
يتم تحرير الخلايا الجرثومية من الأنابيب شبه الصنوبرية من قبل اثنين من الهضم الأنزيمي على التوالي. أول الهضم مع الكولاجين الرابع يفصل الأنابيب شبه الصنوبرية عن طريق إزالة الخلايا الخلالية. قد يؤدي وقت الهضم لفترات طويلة إلى تلف الأنابيب ويؤدي إلى فقدان الحيوانات المنوية، كما لو تم إطلاقها من الأنابيب خلال هذه الخطوة) سيتم التخلص منها في الخطوات التالية. خطوة الهضم الثانية مع التربسين تطلق الخلايا الجرثومية من الأنابيب شبه الصنوبرية. قد يكون هناك تحليل الخلايا في بعض الأحيان وعادة ما تشكل بعض كتل بسبب الحمض النووي الجينومي المفرج عنه. لا ينصح تجاوز المدة المقترحة أو درجة حرارة الهضم، لأن هذا يمكن أن يؤدي إلى ضعف الجدوى، وزيادة اللداء الخلوي، وتكتل. إذا حدث تكتل خفيف، يمكن تجاهل الكتل. ومع ذلك، في حالات التكتل كبيرة وفقدان الخلايا، ينبغي تقليل وقت الهضم التربسين أو التركيز. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن النشاط الأنزيمي للتريبسين قد تختلف بين دفعات وخلال فترات طويلة من التخزين. كمية DNase الأول أثناء هضم التربسين يمكن أيضا زيادة لإزالة كتل الزائدة، ولكن هذا ينبغي أن يعتبر حلا ثانويا. من المهم الحصول على تعليق خلية واحدة متجانسة في نهاية مرحلة ما قبل المعالجة، لأن الخلايا الكتلية سوف الرواسب أسرع، وتلوث الكسور وتعطيل التدرج.
قد يتطلب إنشاء التدرج بعض الممارسة. إذا كان هناك عدم الراحة باستخدام طرف ماصة 5 مل مع وحدة تحكم ماصة، فمن المستحسن استخدام ماصة ميكانيكية عادية 1 مل مع مكبس أملس على نحو سلس ثم قطع نصائح ماصة إلى فتحة من ~ 3 ملم في القطر(الشكل 1B). ومن شأن توسيع الفتحة والتحميل السلس لحلول BSA أن يقلل من خطر خلط التدرج. عند إعدادها بشكل صحيح، فمن الممكن أن نرى الحدود بين حلول BSA المجاورة بسبب مؤشرات الانكسار المختلفة. وينبغي أن ينتج التدرج مباشرة قبل الاستخدام. وتجدر الإشارة أيضا إلى أن أي اهتزاز صغير أو اهتزاز قد يزعج التدرج، لذلك ينبغي تعيين التدرج في بيئة لا يزعجها.
يجب أن يتم تحميل تعليق الخلية على التدرج بعناية فائقة. بعد التحميل، يجب أن يبقى تعليق الخلية على رأس التدرج، والتي تبدأ الخلايا ببطء إلى الرواسب من خلال الطبقة الأولى. إذا شوهدت مجموعات كبيرة من الخلايا تتحرك بسرعة من خلال التدرج، فمن المرجح أن الخلايا لم يتم إعادة تعليقها بعناية أو هناك تكتل زائد. إذا كانت الخلايا لا تبقى على الجزء العلوي من التدرج BSA متقطع عند التحميل ولكن تغرق على الفور بين طبقات BSA 1٪ و 2٪ (الخطوة 3.6)، تعليق الخلية من المرجح أن تكون كثيفة جدا. وقد تم تحسين هذا البروتوكول باستخدام اختبارين لمواس بالغ (80-120 ملغ/تسيس) كمادة بداية؛ على الرغم من أنه تم تنفيذ عمليات العزل الناجحة باستخدام كميات أقل من مواد البداية. وللارتقّيّر البروتوكول والحصول على خلايا جرثومية أكثر إثراءً من أعداد أعلى من الخصيتين، ينبغي إدخال المزيد من أنابيب 50 مل مع التدرج.
تم تطوير البروتوكول في البداية وتحسينه لإثراء الحيوانات المنوية المستديرة من الخصيتين الفأرة الكبار، ومن المتوقع أن يكون نقاء الكسور المنوية المستديرة أكثر من 90٪. بالإضافة إلى الكسور المنوية المستديرة النقية للغاية، تم الحصول على نتائج مرضية لإثراء الخلايا المنوية البشيكية والحيوانات المنوية الممتدة. وتجدر الإشارة إلى أن كريات الدم الحمراء قد تلوث الكسور المنوية التي تمد، وينبغي اتخاذ مزيد من الخطوات للقضاء عليها إذا كان من المتوقع أن يتداخل وجودها مع التحليلات النهائية. لم نتمكن من إثراء أنواع الخلايا الأخرى مثل الخلايا المابية أو الخلايا المتوسطة المبكرة (قبل مرحلة البشيكيتين) من الفئران البالغة باستخدام بروتوكول MDR.
بالإضافة إلى ذلك، تم استخدام الترسيب STA-PUT بنجاح للحصول على كسور غنية من الحيوانات المنوية أو الصرع، اللبتوتين، والحيوانات المنوية zygotene باستخدام الخصيتين الأحداث التي تم جمعها في نقاط زمنية معينة بعد الولادة13. يستفيد هذا النهج من ظهور هذه الأنواع من الخلايا خلال الموجة الأولى من تكوين الحيوانات المنوية. ومن المرجح أن يطبق نفس النهج على إثراء جمهورية إيران رَّابرالالديمقراطية، ولكنه لم يجر اختباره بعد من الناحية العملية. طريقة أخرى هي خيار جيد لتنقية الخلايا المابيوتيكية وmeiotic في مراحل محددة من التمايز هو FACS، الذي لديه ميزة هامة للسماح لعزل أنواع خلايا محددة على أساس وجود علامات محددة14 ،15،16،17.
وعموماً، فإن ترسب سرعة MDR هو طريقة مفيدة لإثراء الخلايا الجرثومية. وفي حين أن هذه الطريقة ليست متفوقة على الأساليب الراسخة الأخرى من حيث نقاء أو كمية الخلايا المخصبة، فإن مزاياها الواضحة هي بساطتها وانخفاض تكاليف الإعداد. هذا، جنبا إلى جنب مع كمية منخفضة من المواد الأولية المطلوبة، وجعل هذا البروتوكول خيارا كبيرا للباحثين في مجال تكوين الحيوانات المنوية وأولئك في مجالات أخرى الذين قد لا ترغب في الاستثمار في الأجهزة المتخصصة أو مجموعات كبيرة من الحيوانات.
The authors have nothing to disclose.
ونود أن نشكر جميع أعضاء مختبر كوتاجا على إسهاماتهم أثناء وضع البروتوكول، والاستخدام والاختبار الفعالين للبروتوكول في مشاريعهم البحثية. ونحن نقدر على وجه الخصوص مساهمة يان ليندستروم للمساعدة في تحسين البروتوكول. وقد حظيت هذه الدراسة بدعم أكاديمية فنلندا، ومؤسسة سيغريد جوسليوس، وبرنامج توركو للدكتوراه في الطب الجزيئي.
4% Paraformaldehyde | Preference of researcher | ||
AlexaFluor488 donkey anti-rabbit IgG | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
AlexaFluor647 donkey anti-mouse IgG | Thermo Fisher Scientific | A-31571 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9647 | |
CaCl2·2H2O | Preference of researcher | ||
Collagenase IV | Sigma | C5138 | |
Complete protease inhibitor cocktail | Roche | 11836145001 | |
DDX4 antibody | Abcam | ab13840 | |
Dextrose | Preference of researcher | ||
DNase I | Worthington | LS006355 | |
GAPDH | HyTest | 5G4 | |
HRP-linked anti-mouse IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA931 | |
HRP-linked anti-rabbit IgG | GE Healthcare Life Sciences | NA934 | |
KCl | Preference of researcher | ||
KH2PO4 | Preference of researcher | ||
MgSO4·7H2O | Preference of researcher | ||
NaCl | Preference of researcher | ||
NaHCO3 | Preference of researcher | ||
NH4Cl | Preference of researcher | ||
Pierce BCA protein assay kit | Life Technologies | 23227 | |
PIWIL1 | Cell Signaling Technology | G82 | |
PIWIL2, clone 13E-3 | Millipore | MABE363 | |
Prolong Diamond Antidafe Mountant with DAPI | Thermo Fisher Scientific | P36962 | for Alexa Fluor immunostainings |
rabbit IgG | Neomarkers | NC-100-P | |
Rhodamine-labelled Peanut agglutinin (PNA) | Vector Laboratories | RL-1072 | |
RIPA buffer | 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1% NP-40, 0.5% w/v sodium deoxycholate, 0.05% w/v SDS, 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 1x protease inhibitor cocktail, 0.2 mM PMSF and 1 mM DTT | ||
TRIsure | Bioline | BIO-38033 | |
Triton X-100 | Preference of researcher | nonionic surfactant | |
Trypsin | Worthington | LS003703 | |
VECTASHIELD Antifade Mounting Medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | for standard DAPI analysis of cell fractions |
γH2AX antibody | Millipore | 05-636 | |
0.22 µm filter | Sartorius | Sartolab BT 180C6 | or equivalent |
1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
1.5 mL or 2 ml tubes | Preference of researcher | ||
40 µm cell sieves for 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 542040 | or equivalent cell strainer |
5 mL serological pipettes | Sarstedt | 86.1254.001 | or equivalent |
50 mL conical tubes | Preference of researcher | ||
6 cm Petri dishes | Preference of researcher | ||
cell culture incubator | Preference of researcher | ||
centrifuge for 50 mL tubes | Preference of researcher | ||
grease pen for microscopy glass slides | Preference of researcher | ||
HulaMixer Sample Mixer | Thermo Fisher Scientific | 15920D | or equivalent cell rotator |
microdissection forcepts | Preference of researcher | ||
microdissection scissors | Preference of researcher | ||
microscopy glass slides and coverslips | Preference of researcher | ||
Nanodrop 1000 | Thermo Scientific | ||
Pipetboy Acu 2 | Integra | 155 000 | or equivalent pipette controller |
refrigerated centrifuge for 1.5 mL tubes | Preference of researcher | ||
tips for 1 ml mechanical pipette | Preference of researcher | ||
water bath | Preference of researcher | ||
widefield fluorescence microscope | Preference of researcher |