פרוטוקול מוצג כדי לזהות במחזור תאים סרטניים בשחלות ניצול מערכת מותאמת אישית של הזרמת פוטואקוסטית וממוקד חומצה פולית-הכתיר נחושת גופרתי.
מחקרים רבים מראים כי הספירה של תאים סרטניים במחזור (CTCs) עשוי להראות הבטחה ככלי התחזיות לסרטן השחלות. אסטרטגיות נוכחיות לאיתור CTCs כוללות זרימה cy, התקנים מיקרו-פלואידים, ותגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (RT-PCR). למרות ההתקדמות האחרונה, שיטות לאיתור גרורות סרטן השחלות המוקדמות עדיין חסר רגישות וספציפיות הנדרשות עבור תרגום קליני. כאן, שיטה הרומן מוצג לאיתור של תאים סרטניים במחזור השחלות על ידי הזרמת פוטואקוסטית cy, שימוש במערכת הדפסה תלת ממדית מותאמת אישית (3D), כולל תא זרימה ומשאבת מזרק. שיטה זו משתמשת חומצה פולית-הכתיר נחושת ננו חלקיקים (פא-CuS NPs) כדי למקד את סקוב-3 תאים סרטניים בשחלות על ידי פכ. עבודה זו ממחישה את האהדה של סוכני הניגוד האלה לתאים סרטניים בשחלות. התוצאות מציגות אפיון NP, זיהוי פג, ו קליטת NP על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטית, ובכך להפגין את הפוטנציאל של המערכת הזאת הרומן לזהות CTCs השחלות בריכוזים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית.
סרטן השחלות הוא אחד ממאירות גינקולוגית הקטלנית והביא המשוער 184,800 מקרי מוות ברחבי העולם ב 20181. מחקרים מרובים הראו את הקורלציה בין התקדמות סרטן השחלות (כלומר, גרורות) ונוכחות של ctcs2,3,4. השיטה הנפוצה ביותר לאיתור ובידוד של CTCs מנצל את מערכת Cellsearch, אשר מטרות קולטן EpCam5. ביטוי EpCam, עם זאת, הוא מוסדר באפיתל למעבר mesenchymal, אשר היה מעורב גרורות סרטן6. למרות ההתקדמות, הטכנולוגיות הקליניות הנוכחיות עדיין סובלות מדיוק נמוך, מעלות גבוהה וממורכבות. בשל החסרונות האלה, טכנולוגיות חדשות לגילוי וספירה של CTCs השחלות הפך לאזור חשוב למחקר.
לאחרונה, פלק התפתחה כשיטה יעילה לזיהוי לא פולשני של תאים סרטניים, ניתוח של ננו, זיהוי של חיידקים7,8,9. פגבי שונה מן זרם הזריחה המסורתית cy, לנסות על ידי זיהוי האנליטים בזרימה על ידי ניצול פוטואקוסטיקה. אפקט פוטואקוסטי מופק כאשר אור לייזר נספג על ידי חומר שגורם הרחבה תרמואלסטית, הפקת גל אקוסטי שניתן לזהות על ידי מתמר אולטרסאונד10,11. היתרונות של פטוג מעל הזרימה המסורתית של השיטות הללו כוללות פשטות, תרגום קלות להגדרות קליניות, ואיתור ctcs בעומקים חסרי תקדים בדגימות החולה12,13. מחקרים שנעשו לאחרונה השתמשו מערכות פלק לאיתור תאים באמצעות אנדודוגני ו בניגוד אקסוגני14,15. ליד אינפרא אדום (ניר) האור סופג סוכני ניגודיות כגון לצבוע ירוק indocyanine, ו מתכת NPs (למשל, זהב ו-CuS) שימשו תיוג סלקטיבי של תאים ורקמות בשילוב עם הדמיה פוטואקוסטית16,17,18. בשל עומק החדירה המשופר של אור ניר בתוך רקמות ביולוגיות, זיהוי פוטואקוסטי של בולמי ניתן לבצע בעומקים גדולים יותר עבור יישומים קליניים. בשל הפוטנציאל הגדול שלה לשימוש במרפאה, השילוב של סוכני ניגוד ממוקד של ניר עם פלק יצר עניין רב באיתור CTCs.
בשילוב עם סוכני ניגודיות ממוקדים מספק גישה משופרת לניתוח תפוקה גבוהה של דגימות מטופלים עם דיוק משופר וזיהוי ממוקד של CTCs. אחת מאסטרטגיות הזיהוי העיקריות של CTCs היא המיקוד הספציפי של חלבונים ממברנה נוכח בתא העניין. אחד המאפיינים הבולטים של CTCs השחלות הוא ביטוי יתר של קולטני חומצה פולית הממוקם על הממברנה החיצונית שלהם19. קולטן חומצה פולית מיקוד היא אסטרטגיה אידיאלית לזיהוי של CTCs השחלות בדם בגלל תאים אנדוגניים, אשר יש ביטוי גבוה יותר של קולטני חומצה פולית, הם בדרך כלל לומיאל ויש להם חשיפה מוגבלת למחזור הדם20. נחושת גופרתי NPs (קוס NPs) הכירו לאחרונה על יכולתם למקד קולטני חומצה פולית הביע על תאים סרטניים21. בשילוב עם תאימות ביולוגית שלהם, קלות הסינתזה והקליטה עמוק בניר, סוכני הניגודיות של NP אלה משלבים אסטרטגיית פילוח אידיאלית לאיתור השחלות CTCs באמצעות פכ.
עבודה זו מתארת את הכנת הפא-קוס NPs והשימוש בהם לאיתור תאים סרטניים בשחלות במערכת הזרמת פוטואקוסטית. CuS NPs משתנים עם חומצה פולית כדי במיוחד למקד CTCs השחלות לפלוט אות פוטואקוסטי כאשר מגורה עם 1,053 ננומטר לייזר. התוצאות מצביעות על גילוי מוצלח של תאים סרטניים בשחלות מודבטים עם אלה הסוכנים הניגוד פוטואקוסטי בתוך מערכת פכ. תוצאות אלה מציגות זיהוי של תאים סרטניים בשחלות למטה לריכוזים של תא 1/μL, ומיקרוסקופ פלואורסצנטית מאשרת ספיגה מוצלחת של חלקיקים אלה על ידי סקוב-3 סרטן השחלות תאים22. עבודה זו מספקת תיאור מפורט של סינתזה פא-קוס NPs, הכנת דגימות עבור מיקרוסקופ פלואורסצנטית, בנייה של מערכת הזרימה פוטואקוסטית, וזיהוי פוטואקוסטי של תאים סרטניים בשחלות. השיטה המוצגת מציגה זיהוי מוצלח של CTCs השחלות בזרימה ניצול פא-CuS NPs. העבודה העתידית תתמקד ביישום הקליני של טכנולוגיה זו לקראת גילוי מוקדם של גרורות סרטן השחלות.
פרוטוקול זה הוא שיטה ישירה לזיהוי של CTCs השחלות ניצול פג ו סוכן ניגודיות ממוקד של CuS. שיטות רבות נחקרו לאיתור ctcs השחלות, כולל התקנים microflu, RT-PCR, ו זרם הזריחהcy, 22,24,25. טווח זה במורכבות, עלות ודיוק, הגבלת האפקטיביות שלהם בהגדרות הקליניות. פגלה מצי…
The authors have nothing to disclose.
המחברים רוצים להכיר את מדלן האוול על עזרתה עם סינתזה, מתיו החזה על עזרתו עיצוב מערכת הזרימה, ואיתן מרשהכל לקבלת סיוע עם SolidWorks.
0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
3D Printed Tank | Custom-made | ||
Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |