광음향 유동 세포측정을 이용한 난소암 검출
Summary
프로토콜은 맞춤형 광음향 흐름 시스템 및 표적 엽산 덮인 구리 황화물 나노 입자를 활용하여 순환 난소 종양 세포를 검출하기 위해 제시된다.
Abstract
많은 연구는 순환 종양 세포의 열거제안 (CTC) 난소 암에 대한 예후 도구로 약속을 표시 할 수 있습니다. CTC 검출을 위한 현재 전략에는 유세포 분석, 미세 유체 장치 및 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이 포함됩니다. 최근의 발전에도 불구하고, 조기 난소암 전이를 검출하는 방법은 여전히 임상 번역에 필요한 민감도 및 특이성이 결여되어 있다. 여기서, 유동챔버 및 주사기 펌프를 포함하는 맞춤형 3차원(3D) 인쇄 시스템을 활용한 광음향 유동 세포분석(PAFC)에 의한 난소 순환 종양 세포의 검출을 위한 새로운 방법이 제시된다. 이 방법은 엽산으로 덮인 구리 황화물 나노 입자 (FA-CuS NPs)를 사용하여 PAFC에 의해 SKOV-3 난소 암 세포를 표적으로 합니다. 이 작품은 난소 암 세포를 위한 이 조영제의 친화성을 보여줍니다. 결과는 형광 현미경 검사법에 의하여 NP 특성, PAFC 탐지 및 NP 장악을 보여주고, 따라서 생리적으로 관련있는 농도에서 난소 CTC를 검출하는 이 새로운 시스템의 잠재력을 보여줍니다.
Introduction
난소암은 가장 치명적인 부인과 악성 종양 중 하나이며 2018 년 전 세계적으로 약 184,800 명의 사망자가발생했습니다 1. 다중 연구는 난소암 진행 (즉, 전이)과CTCs2,3,4의존재 사이의 상관 관계를 보여주었습니다. CTC의 검출 및 격리를 위한 가장 일반적인 방법은 EpCam 수용체5를표적으로 하는 셀서치 시스템을 이용합니다. EpCam 발현은, 그러나, 암 전이6에서 연루된 중간엽 전이에 상피에서 하향조절된다. 진보에도 불구하고, 현재의 임상 기술은 여전히 낮은 정확도, 높은 비용 및 복잡성으로 고통받고 있습니다. 이러한 단점으로 인해 난소 CTC의 발견 및 열거를 위한 새로운 기술이 연구의 중요한 영역이 되었습니다.
최근, PAFC는 암세포의 비침습적 검출, 나노물질의 분석 및 박테리아의 식별을 위한 효과적인 방법으로 나타났다7,8,9. PAFC는 광음향을 활용하여 유동 분석액을 검출하여 기존의 형광 유동 세포측정과 다릅니다. 광음향 효과는 레이저 빛이 열탄성 팽창을 일으키는 물질에 의해 흡수될 때 생성되며, 초음파 트랜스듀서10,11에의해 검출될 수 있는 음향파를 생성한다. 전통적인 유량 세포 분석 방법에 비해 PAFC의 장점은 단순성, 임상 설정으로의 번역 용이성 및 환자 샘플12,13에서전례없는 깊이에서 CTC의 검출을 포함한다. 최근 연구는 내인성 및 외인성대조14,15를사용하여 세포의 검출을 위한 PAFC 시스템을 활용하고 있다. 근적외선(NIR) 광흡수 조영제 예컨대 인도시아닌 녹색 염료, 및 금속 NPs(예를 들어, 금 및 CuS)는 광음향 이미징16,17,18과함께 세포 및 조직의 선택적 라벨링에 사용되어 왔다. 생물학적 조직 내에서 NIR 광의 침투 깊이가 개선되어 흡수제의 광음향 검출이 임상 응용을 위해 더 깊은 곳에서 수행될 수 있습니다. 클리닉에서 사용할 수 있는 잠재력이 뛰어나기 때문에 표적 NIR 조영제와 PAFC의 조합은 CTC 검출에 상당한 관심을 불러일으켰습니다.
표적 조영제와 함께 PAFC는 CTC의 향상된 정확도 및 표적 검출을 통해 환자 샘플의 높은 처리량 분석을 위한 향상된 접근 방식을 제공합니다. CTC를 위한 주요 검출 전략의 한개인은 관심 있는 세포에 존재하는 막 단백질의 특정 표적화이다. 난소 CTC의 한 가지 주목할만한 특징은 외부 막19에위치한 엽산 수용체의 과발현입니다. 엽산 수용체 표적화는 엽산 수용체의 발현이 더 높은 내인성 세포가 일반적으로 발광이고 혈류량20에제한된 노출을 가지고 있기 때문에 혈액에서 난소 CTC의 식별을위한 이상적인 전략이다. 구리 황화물 NPs(CuS NPs)는 최근암세포(21)에발현된 엽산 수용체를 표적으로 하는 능력으로 인정받고 있다. 생체 적합성, 합성 용이성 및 NIR 깊숙이 흡수되는 이 NP 조영제는 PAFC를 활용한 난소 CTC 검출을 위한 이상적인 표적화 전략을 수립합니다.
이 작품은 광음향 흐름 시스템에서 난소 암 세포의 검출을 위한 FA-CuS NPs의 제조 및 그들의 사용을 기술합니다. CuS NPs는 엽산으로 변형되어 난소 CTC를 구체적으로 표적으로 하고 1,053 nm 레이저로 자극될 때 광음향 신호를 방출합니다. 결과는 PAFC 시스템 내의 이러한 광음향 조영제로 배양된 난소암세포의 성공적인 검출을 나타낸다. 이러한 결과는 난소암세포의 검출을 1세포/μL의 농도까지, 및 형광 현미경검사법은 SKOV-3난소암세포(22)에의한 이들 입자의 성공적인 섭취를 확인시켜 준다. 이 작품은 FA-CuS NPs 합성, 형광 현미경 검사법 시료 의 준비, 광음향 흐름 시스템의 구성 및 난소 암 세포의 광음향 검출에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 제시된 방법은 FA-CuS NPs를 이용한 유동에서 난소 CTC의 성공적인 식별을 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 PAFC 및 표적 CuS 조영제를 활용하는 난소 CTC의 검출을 위한 간단한 방법이다. 미세유체 장치, RT-PCR 및 형광 유동세포측정법 23,24,25를포함하는 난소 CTC의 검출을 위한 많은 방법이 탐구되었다. 이러한 복잡성, 비용 및 정확도범위는 임상 환경에서의 효율성을 제한합니다. PAFC는 환자 샘플 내에서 CTC를 검출하는 기?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 합성에 대한 그녀의 도움마들렌 하웰을 인정하고 싶습니다, 흐름 시스템을 설계하는 그의 도움 매튜 가슴, 솔리드 웍스에 대한 도움에 대한 에단 마샬.
Materials
| 0.025% Trypsin With EDTA | Corning | 25-053-Cl | |
| 0.2 µm 1000 mL Vacuum Filtration Unit | VWR | 10040-440 | For filtering larger volumes of DI water. |
| 0.2 µm sterile syringe filter | VWR | 28145-477 | |
| 3D Printed Tank | Custom-made | ||
| Acquisition Card | National Instruments | PXIe-5170R | 250 MS/s, 8-Channel, 14-bit |
| Alconox | Sigma-Aldrich | 242985-1.8KG | Detergent used for cleaning glassware. |
| Amicon Ultra-15 Centrifugal Filters | Millipore | UFC903024 | |
| Amicon Ultra-4 Centrifugal Filters | Millipore | UFC803024 | |
| Bright-Line Hematocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Copper(II) Chloride | ACROS ORGANICS | 206532500 | |
| Coupling Objective | Thorlabs | LMH-10x-532 | To couple pulsed light to optical fiber. |
| Coupling Stage | Newport | F-91-C1-T | Stage for coupling pulsed light to objective. Holds FP-1A and LMH-10x-532 |
| CPX Series Digital Ultrasonic Cleaning Bath | Fisherbrand | Model CPX3800 | |
| Data Acquisition software | National Instruments | NI LabVIEW 2017 (32-bit) | LabVIEW used to synchronize laser pulses with data acquisition. |
| Data Processing Software | Mathworks | Matlab R2016a | Reconstructions and graphs produced using Matlab software. |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442-500ML | |
| Fiber Chuck | Newport | FPH-DJ | Used to hold the bare fiber. |
| Fiber Coupler | Newport | FP-1A | 3-Axis stage for positioning fiber chuck and optical fiber at the focus of the objective. |
| Folic Acid | Sigma-Aldrich | F7876-10G | |
| Formvar Coated TEM Grids | Electron Microscopy Sciences | FCF300-CU-SB | |
| Masterflex Tubing | Cole Parmer | EW-96420-14 | |
| McCoy's 5A Medium | ATCC | 30-2007 | |
| Norm-Ject 10 mL Syringes | HENKE SASS WOLF | 4100-X00V0 | |
| Optical Fiber | Thorlabs | FG550LEC | Used to expose sample to pulsed light. |
| PBS | Alfa Aesar | J62036 | |
| Penicillin Streptomycin | GIBCO | 15140-122 | |
| Pulsed Laser | RPMC Lasers Inc | Quantus-Q1D-1053 | Pulsed laser source with specifications 1053 nm, 8 ns pulse, 10 Hz maximum. |
| Pulser/Receiver | Olympus | 5077PR | Receives, filters, and amplifies photoacoustic signals. Operated with 59 dB Gain. |
| Quartz Capillary Tube | Sutter Instrument | QF150-75-10 | |
| RPMI Midum 1640 (1X) Folic Acid Free | Gibco | 27016-021 | |
| Silicone | Momentive Performance Materials, Inc. | GE284 | |
| SKOV-3 Cells | ATCC | HTB-77 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma-Aldrich | S5761 | |
| Sodium Carbonate | Sigma-Aldrich | S7795-500G | |
| Sodium Hydroxide Beads | BDH | BDH9292-500G | |
| Sodium Sulfide Nonahydrate | Sigma-Aldrich | 431648-50G | |
| Syringe Pumps | New Era Pump Systems Inc | DUAL-1000 | |
| Texas Red-X-Succinimydl ester | Invitrogen | 1949071 | |
| Transducer | Olynmpus | V214-BB-RM | Ultrasound detector with central frequency of 50 MHz and -6 dB fractional bandwidth of 82%. |
| Trypan Blue Solution .4% | Amresco | K940-100ML | |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P7949-100ML | |
| Ultrasound Gel | Parker Laboratories Inc. | Aquasonic 100 | Ultrasound gel for transducer coupling |
Riferimenti
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