Bildebehandling og analyse av vevsorientering og vekstdynamikk i developing Drosophila Epithelia under pupal stadier

Summary

Denne protokollen er designet for avbildning og analyse av dynamikken i celleorientering og vevsvekst i Drosophila abdominal epithelia som fruktfluen gjennomgår metamorfose. Metodikken som er beskrevet her, kan brukes på studiet av ulike utviklingsstadier, vev og subcellulære strukturer i Drosophila eller andre modellorganismer.

Abstract

Innenfor flercellede organismer viser modne vev og organer høye grader av orden i de romlige arrangementene til deres bestanddeler celler. Et bemerkelsesverdig eksempel er gitt av sensorisk epithelia, hvor celler av samme eller distinkte identiteter er samlet via cellecelleadhesjon som viser svært organiserte planarmønstre. Celler justeres til hverandre i samme retning og viser tilsvarende polaritet over store avstander. Denne organiseringen av den modne epithelia er etablert i løpet av morfogenese. For å forstå hvordan den planære ordningen av den modne epithelia oppnås, er det avgjørende å spore celleorientering og vekstdynamikk med høy spatiotemporal gjengivelse under utviklingen in vivo. Robuste analytiske verktøy er også avgjørende for å identifisere og karakterisere lokale til globale overganger. Drosophila pupa er et ideelt system for å evaluere orientert celleform endrer underliggende epitelmorogenese. Det pupale utviklende epitelet utgjør den ytre overflaten av immobile kroppen, slik at langsiktig avbildning av intakte dyr. Protokollen som er beskrevet her er utformet for å bilde og analysere celleatferd på både globale og lokale nivåer i pupal abdominal epidermis som den vokser. Metodikken som er beskrevet, kan enkelt tilpasses avbildningen av celleatferd i andre utviklingsstadier, vev, subcellulære strukturer eller modellorganismer.

Introduction

For å oppnå sine roller, epitelvev fullt ut stole på den romlige organiseringen av sine cellulære komponenter. I de fleste epithelia er celler ikke bare pakket mot hverandre for å skape et presist brosteinslag, men de orienterer seg i forhold til kroppsaksene.

Den funksjonelle betydningen av presis vevsorganisasjon er åpenbar i sensorisk epithelia, som virveldyr indre øre og netthinnen. I det første tilfellet justerer hår- og støtteceller i en bestemt aksial retning for effektivt å føle mekaniske innganger som lyd og bevegelse^1,2. På samme måte er fotoreseptorcelle romlig organisasjon avgjørende for å oppnå optimale optiske egenskaper ved netthinnen³. Romlig kontroll av celleposisjon og orientering er dermed av særlig relevans for riktig fysiologisk funksjon.

Drosophila er et holometaboløs insekt som gjennomgår en fullstendig transformasjon av larvalkroppsstrukturene gjennom metamorfose, noe som gir opphav til sitt voksne vev. Drosophila pupa er en utmerket modell for noninvasiv levende avbildning av en rekke dynamiske hendelser, inkludert utviklingscellemigrasjon^4,celledeling og vekstdynamikk^5,muskelsammentrekning^6,celledød^7,sårreparasjon⁸og celleorientering⁹. I den voksne Drosophilaviser det eksterne epitelet en høy grad av orden. Dette observeres lett på arrangementer av trichomes (dvs. celle fremspring som stammer fra enkelt epitelceller) og sensoriske bust over hele flyets kroppsoverflate¹⁰. Faktisk er trichomes justert i parallelle rader som styrer luftstrømmen¹¹. Morfogenesen til den voksne epithelia og det bestilte arrangementet av de enkelte cellene starter under embryogenese og kulminerer under pupale stadier. Mens i embryoer celledelinger, intercalations, og form endrer alle redusere vevsorden^12,13, dette er tilbake på senere stadier av utviklingen, spesielt på pupal stadier, når flyet nærmer modenhet⁹.

Immobile Drosophila pupa gir et ideelt system for å evaluere celleform og orienteringsendringer. Den pupale abdominal epidermis presenterer spesielle fordeler. Mens forløperne til det voksne hodet, thorax, kjønnsorganer og vedlegg vokser og blir mønstret fra larvestadier, histoblasts, som er integrert i larval epidermis, begynner å vokse og differensiere bare ved pupariation¹⁴. Denne funksjonen tillater sporing av alle spatiotemporal hendelser involvert i etableringen av vev orden i sin helhet⁹.

Histoblasts er spesifisert under embryonal utvikling ved kontralaterale stillinger i hvert presumptivt buksegment. Den dorsale abdominal epidermis av den voksne stammer fra dorsolaterally plassert histoblast reir tilstede i fremre og bakre rom^15,16. Etter hvert som histoblaster utvides, erstatter larval epitelceller (LECer), smelter de kontralaterale reirene ved dorsalmidlinjen som danner et sammenføyningsark^{17,,18,,19,,20}.

Dette arbeidet beskriver 1) en metodikk for disseksjon, montering og langsiktig levende avbildning av Drosophila-puppene, og 2) analytiske metoder for å studere dynamikken i cellulær orientering og vekst ved høy spatiotemporal oppløsning. En detaljert protokoll er gitt her, som dekker alle trinnene som kreves fra den første pupae forberedelse (dvs. iscenesettelse og bildebehandling) til utvinning og kvantifisering av retningsretningsitet og orientering funksjoner. Vi beskriver også hvordan man utlede lokale vevsegenskaper fra analysen av cellekloner. Alle de beskrevne trinnene er minimalt invasive og tillater langsiktige live analyser. Metodene som er beskrevet her, kan enkelt tilpasses og brukes på andre utviklingsstadier, vev eller modellorganismer.

Protocol

MERK: Denne protokollen er delt inn i fem trinn: (1) iscenesettelse av puppene, (2) forbereder puppene for avbildning, (3) levende avbildning av den voksende abdominale epithelia, (4) generasjon av genetiske mosaikker, (5) databehandling og analyse (inkludert seksjoner som beskriver hvordan man analyserer celleorienteringsdynamikk fra cellekryssskinser og vekstdynamikk fra cellekloner). 1. Iscenesettelse av Drosophila pupae før avbildning Kultur flyr av riktig genotype på …

Representative Results

Protokollen beskrevet ovenfor dekker utarbeidelsen av Drosophila pupae for langsiktig levende bildebehandling og prosedyrene for analyse av celleorientering og vekstdynamikk i abdominal epidermis. Ved å bruke denne metoden er det mulig å generere høyoppløselige filmer av den utviklende puppene i perioder på opptil 48 timer uten betydelig fotobleking eller fototoksisitet. Øyeblikksbilder som viser abdominal epidermis (f.eks. histoblasts og LECer) på forskjellige tidspunkter…

Discussion

Lang rekkevidde er en viktig egenskap ved de fleste funksjonelle fysiologiske enheter. Under morfogenese oppnås orden gjennom integrering av komplekse instruksjoner implementert med høy temporal og romlig presisjon. Flere og multilevel begrensninger er integrert i stereotype vev ordninger.

Polaritet og retningsbestemthet er avgjørende for å bestille romlig ordning under utvikling. Polaritet innebærer symmetribrudd under utviklingen. Oppnåelse av asymmetri er nødvendig for fastsettelse a…

Materials

Analysis Software	–	ImageJ	Analyzing data
Drosophila	Atpa::GFP	–	Strains employed for data collection
Drosophila	hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls	–	Strains employed for data collection
Dumont 5 Forceps	FST	11251-20	1.5 mm diameter for dissection
Glass Bottom Plates	Mat Tek	P35G-0.170-14-C	Mounting pupae for data collection
Halocarbon Oil 27	Sigma-Aldrich	9002-83-9	mounting pupae
Inverted Confocal microscope	Zeiss	LSM700	Data collection
Stereomicroscope	Leica	DFC365FX	Visualization of the pupae during dissection