Billeddannelse og analyse af vævsorientering og vækstdynamik i udvikling af Drosophila Epithelia under pupalfaser
Summary
Denne protokol er designet til billeddannelse og analyse af dynamikken i celleorientering og vævsvækst i Drosophila abdominal epithelia som frugtfluen gennemgår metamorfose. Den metode, der er beskrevet her, kan anvendes til undersøgelse af forskellige udviklingsstadier, væv og subcellulære strukturer i Drosophila eller andre modelorganismer.
Abstract
Inden for flercellede organismer udviser modne væv og organer høje grader i rækkefølge i de rumlige ordninger af deres bestanddele. Et bemærkelsesværdigt eksempel er givet ved sensorisk epithelia, hvor celler af samme eller forskellige identiteter samles via celle-celle vedhæftning viser velorganiseret planær mønstre. Celler justerer til hinanden i samme retning og viser tilsvarende polaritet over store afstande. Denne organisation af den modne epithelia er etableret i løbet af morfogenese. For at forstå, hvordan den planar arrangement af den modne epithelia opnås, er det afgørende at spore celle orientering og vækst dynamik med høj spatiotemporal troskab under udvikling in vivo. Robuste analytiske værktøjer er også afgørende for at identificere og karakterisere lokale til globale overgange. Den Drosophila puppe er et ideelt system til at evaluere orienteret celle form ændringer underliggende epitel morfogenese. Den pupal udvikle epitel udgør den ydre overflade af immobile kroppen, så langsigtet billeddannelse af intakte dyr. Protokollen beskrevet her er designet til at billedet og analysere celle adfærd på både globalt og lokalt plan i pupal abdominal epidermis som det vokser. Den beskrevne metode kan let tilpasses til billeddannelse af celle adfærd på andre udviklingsstadier, væv, subcellulære strukturer, eller model organismer.
Introduction
For at opnå deres roller, epitelvæv fuldt ud stole på den rumlige organisering af deres cellulære komponenter. I de fleste epithelia, celler er ikke kun pakket mod hinanden for at skabe en præcis brosten lag, men de orientere sig i forhold til kroppen akser.
Den funktionelle betydning af præcise væv organisation er indlysende i sensorisk epithelia, såsom hvirveldyr indre øre og nethinden. I det første tilfælde justeres hår og støtteceller i en bestemt aksial retning for effektivt at fornemme mekaniske indgange som lyd og bevægelse1,2. Tilsvarende fotoreceptor celle rumlige organisation er afgørende for at opnå optimale optiske egenskaber ved nethinden3. Rumlig kontrol af celleposition og -orientering er således af særlig relevans for korrekt fysiologisk funktion.
Drosophila er en holometabolous insekt, der gennemgår en fuldstændig transformation af sine larve kropsstrukturer gennem metamorfose, hvilket giver anledning til sin voksne væv. Den Drosophila puppe er en glimrende model for noninvasive levende billeddannelse af en række dynamiske begivenheder, herunder udviklingsmæssige celle migration4,celledeling og vækstdynamik5, muskelsammentrækning6,celledød7,sår reparation8, og celle orientering9. I den voksne Drosophila, den eksterne epitel viser en høj grad af orden. Dette er let observeret på arrangementer af trichomes (dvs. celle fremspring stammer fra enkelt epitelceller) og sensoriske børster over hele fluens krop overflade10. Faktisk er trichomes justeret i parallelle rækker vejledende luftstrøm11. Morfogenesen af den voksne epithelia og den bestilte placering af de enkelte celler starter under embryogenese og kulminerer under pupal stadier. Mens celledelinger, interkaleringer og form ændrer alle fald i vævsretningen12,13,tilbageføres dette på senere udviklingsstadier, især på hvalpestadier , når fluen nærmer sig modenhed9.
Den immobile Drosophila puppe giver et ideelt system til at evaluere celle form og orientering ændringer. Den pupal abdominal epidermis præsenterer særlige fordele. Mens prækursorer af den voksne hoved, brystkasse, kønsorganer, og vedhæng vokse og få mønstret fra larve stadier, histoblaster, som er integreret i larve epidermis, begynde at vokse og differentiere kun ved pupariation14. Denne funktion gør det muligt at spore alle spatiotemporale hændelser, der er involveret i etableringen af vævsorden i sin helhed9.
Histoblaster er specificeret under embryonal udvikling på kontralaterale positioner i hver formodede abdominal segment. Den dorsale abdominale epidermis af den voksne stammer fra dorsolaterally placeret histoblast reder til stede på den forreste og bageste rum15,16. Som histoblaster udvide, udskiftning af larve epitelceller (LECs), de kontralaterale reder sikring på dorsale midterlinjen danner et sammenløb ark17,18,19,20.
Dette arbejde beskriver 1) en metode til dissektion, montering, og langsigtet levende billeddannelse af Drosophila puppe, og 2) analytiske metoder til at studere dynamikken i cellulære orientering og vækst ved høj spatiotemporal opløsning. Der findes her en detaljeret protokol, der dækker alle de trin, der kræves fra det første pupa-præparat (dvs. iscenesættelse og billeddannelse) til udvinding og kvantificering af retningsbestemthed og orienteringsfunktioner. Vi beskriver også, hvordan man udleder lokale vævsegenskaber fra analysen af cellekloner. Alle de beskrevne trin er minimalt invasive og tillader langsigtede liveanalyser. De metoder, der er beskrevet her, kan let tilpasses og anvendes på andre udviklingsstadier, væv eller modelorganismer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Langtrækkende orden er en væsentlig egenskab ved de fleste funktionelle fysiologiske enheder. Under morfogenese opnås orden gennem integration af komplekse instruktioner implementeret med høj tidsmæssig og rumlig præcision. Flere og flere niveauer begrænser er integreret i stereotype væv arrangementer.
Polaritet og retningsbestemthed er afgørende for ordnet rumligt arrangement under udvikling. Polaritet indebærer symmetri bryde under udviklingen. Det er nødvendigt at opnå asymmetri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmerne af martín-blanco-laboratoriet for nyttige drøftelser. Vi takker også Nic Tapon (The Crick Institute, London, UK), Bloomington Stock Center (University of Indiana, USA) og FlyBase (for Drosophila genanmærkning). Federica Mangione blev støttet af et JAE-CSIC prædoc.stipendium. Martín-Blanco-laboratoriet blev finansieret af Laboratoriumet Programa Estatal de Fomento de la Investigación Científica y Técnica de Excelencia (BFU2014-57019-P og BFU2017-82876-P) og fra Fundación Ramón Areces.
Materials
| Analysis Software | – | ImageJ | Analyzing data |
| Drosophila | Atpa::GFP | – | Strains employed for data collection |
| Drosophila | hsflp1.22;FRT40A/FRT40A Ubi.RFP.nls | – | Strains employed for data collection |
| Dumont 5 Forceps | FST | 11251-20 | 1.5 mm diameter for dissection |
| Glass Bottom Plates | Mat Tek | P35G-0.170-14-C | Mounting pupae for data collection |
| Halocarbon Oil 27 | Sigma-Aldrich | 9002-83-9 | mounting pupae |
| Inverted Confocal microscope | Zeiss | LSM700 | Data collection |
| Stereomicroscope | Leica | DFC365FX | Visualization of the pupae during dissection |
Riferimenti
- Gillespie, P. G., Muller, U. Mechanotransduction by hair cells: models, molecules, and mechanisms. Cell. 139, 33-44 (2009).
- Deans, M. R. A balance of form and function: planar polarity and development of the vestibular maculae. Seminars in Cellular and Developmental Biology. 24, 490-498 (2013).
- Stell, W. K. The structure and morphologic relations of rods and cones in the retina of the spiny dogfish, Squalus. Comparative Biochemistry and Physiology – Part A: Comparative Physiology. 42, 141-151 (1972).
- Ninov, N., Chiarelli, D. A., Martin-Blanco, E. Extrinsic and intrinsic mechanisms directing epithelial cell sheet replacement during Drosophila metamorphosis. Development. 134, 367-379 (2007).
- Bosveld, F., et al. Mechanical control of morphogenesis by Fat/Dachsous/Four-jointed planar cell polarity pathway. Science. 336, 724-727 (2012).
- Puah, W. C., Wasser, M. Live imaging of muscles in Drosophila metamorphosis: Towards high-throughput gene identification and function analysis. Methods. 96, 103-117 (2016).
- Teng, X., Qin, L., Le Borgne, R., Toyama, Y. Remodeling of adhesion and modulation of mechanical tensile forces during apoptosis in Drosophila epithelium. Development. 144, 95-105 (2017).
- Weavers, H., et al. Systems Analysis of the Dynamic Inflammatory Response to Tissue Damage Reveals Spatiotemporal Properties of the Wound Attractant Gradient. Current Biology. 26, 1975-1989 (2016).
- Mangione, F., Martin-Blanco, E. The Dachsous/Fat/Four-Jointed Pathway Directs the Uniform Axial Orientation of Epithelial Cells in the Drosophila Abdomen. Cell Reports. 25, 2836-2850 (2018).
- Casal, J., Struhl, G., Lawrence, P. A. Developmental compartments and planar polarity in Drosophila. Current Biology. 12, 1189-1198 (2002).
- Wootton, R. How flies fly. Nature. 400, 112-113 (1999).
- Zallen, J. A., Wieschaus, E. Patterned gene expression directs bipolar planar polarity in Drosophila. Developmental Cell. 6, 343-355 (2004).
- Gibson, M. C., Patel, A. B., Nagpal, R., Perrimon, N. The emergence of geometric order in proliferating metazoan epithelia. Nature. 442, 1038-1041 (2006).
- Robertson, C. W. The metamorphosis of Drosophila melanogaster, including an accurately timed account of the principal morphological changes. Journal of Morphology. 59, 351-399 (1936).
- Mandaravally Madhavan, M., Schneiderman, H. A. Histological analysis of the dynamics of growth of imaginal discs and histoblast nests during the larval development of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 183, 269-305 (1977).
- Kornberg, T. Compartments in the abdomen of Drosophila and the role of the engrailed locus. Biologia dello sviluppo. 86, 363-372 (1981).
- Garcia-Bellido, A., Merriam, J. R. Clonal parameters of tergite development in Drosophila. Biologia dello sviluppo. 26, 264-276 (1971).
- Roseland, C. R., Schneiderman, H. A. Regulation and metamorphosis of the abdominal histoblasts of Drosophila melanogaster. Wilhelm Roux’s archives of Developmental Biology. 186, 235-265 (1979).
- Madhavan, M. M., Madhavan, K. Morphogenesis of the epidermis of adult abdomen of Drosophila. Journal of Embryology and Experimental Morphology. 60, 1-31 (1980).
- Bischoff, M., Cseresnyes, Z. Cell rearrangements, cell divisions and cell death in a migrating epithelial sheet in the abdomen of Drosophila. Development. 136, 2403-2411 (2009).
- Golic, K. G., Lindquist, S. The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome. Cell. 59, 499-509 (1989).
- Xu, T., Rubin, G. M. Analysis of genetic mosaics in developing and adult Drosophila tissues. Development. 117, 1223-1237 (1993).
- Fonck, E., et al. Effect of aging on elastin functionality in human cerebral arteries. Stroke. 40, 2552-2556 (2009).
- Rezakhaniha, R., Fonck, E., Genoud, C., Stergiopulos, N. Role of elastin anisotropy in structural strain energy functions of arterial tissue. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 10, 599-611 (2011).
- Hammer, &. #. 2. 1. 6. ;., Harper, D. A., Ryan, P. D. PAST: paleontological statistics software package for education and data analysis. Palaeontologia electronica. 4, 1-9 (2001).
- Gray, R. S., Roszko, I., Solnica-Krezel, L. Planar cell polarity: coordinating morphogenetic cell behaviors with embryonic polarity. Developmental Cell. 21, 120-133 (2011).
- Vogg, M. C., Wenger, Y., Galliot, B. How Somatic Adult Tissues Develop Organizer Activity. Current Topics in Developmental Biology. 116, 391-414 (2016).
- Collinet, C., Rauzi, M., Lenne, P. F., Lecuit, T. Local and tissue-scale forces drive oriented junction growth during tissue extension. Nature Cell Biology. 17, 1247-1258 (2015).
- Martin-Blanco, E., et al. puckered encodes a phosphatase that mediates a feedback loop regulating JNK activity during dorsal closure in Drosophila. Genes and Development. 12, 557-570 (1998).
- Dye, N. A., et al. Cell dynamics underlying oriented growth of the Drosophila wing imaginal disc. Development. 144, 4406-4421 (2017).
- Williams-Masson, E. M., Malik, A. N., Hardin, J. An actin-mediated two-step mechanism is required for ventral enclosure of the C. elegans hypodermis. Development. 124, 2889-2901 (1997).
- Ferguson, M. W. Palate development. Development. 103, 41-60 (1988).
