Vi beskriver ett protokoll för cell-typ specifikt uttryck för den genetiskt kodade FRET-baserade sensorn ATeam 1,03Yemk i organotypic slice kulturer av musen framhjärnan. Dessutom visar vi hur man använder denna sensor för dynamisk avbildning av cellulära ATP nivåer i nervceller och astrocyter.
Neuronal aktivitet i centralanervsystemet (CNS) framkallar en hög efterfrågan på cellulär energi från nedbrytningen av adenosintrifosfat (ATP). En stor del av ATP behövs för att ominstallera Jon gradienter över plasmamembran bryts ned av elektrisk signalering av nervceller. Det finns bevis för att astrocyter-samtidigt inte generera snabba elektriska signaler själva-genomgår ökad produktion av ATP som svar på neuronala aktivitet och stödja aktiva nervceller genom att ge energimetaboliter till dem. Den senaste utvecklingen av genetiskt kodade sensorer för olika metaboliter nu möjliggör studiet av sådana metaboliska interaktioner mellan nervceller och astrocyter. Här beskriver vi ett protokoll för cell-typ specifikt uttryck för ATP-känsliga Fluorescence resonans energiöverföring-(FRET-) sensor ATeam 1,03Yemk i organotypic vävnad slice kulturer av musen hippocampus och cortex med Adeno-associerade virala vektorer (AAV). Vidare, vi visar hur denna sensor kan användas för dynamisk mätning av förändringar i cellulära ATP nivåer i nervceller och astrocyter på ökningar av extracellulära kalium och efter induktion av kemisk ischemi (dvs., en hämning av cellulära energimetabolism).
Excitatoriska elektrisk aktivitet av nervceller är till stor del baserat på flödet av katjoner såsom natrium (na+) och kalium (K+) över deras plasmamembran. Underhåll av elektrokemiska gradienter av dessa två joner krävs därför för signalering. Detta åstadkoms genom cellulära na+/k+-ATPAS (nka), en ubiquitously uttryckt elektrogena transmembranpump, som extruderar 3 na+ ut ur cellen i utbyte mot 2 K+ från extracellulära rymden, som kräver konsumtion av en molekyl av ATP per transport cykel1. Förutom NKA, det finns flera andra ATP-konsumerar Jon transportörer inklusive plasmamembranet ca2 +-ATPas, vilket är viktigt för intracellulära ca2 + homeostas och dess export efter aktivitetsinducerad tillströmning2. I presynaptiska blåsor, en vacuolar-typ H+-ATPas (v-ATPas) skapar protongradienten som krävs för signalsubstansen upptag i detta fack3.
Medan aktiviteten hos nervceller kräver därför en betydande mängd ATP4, de uppvisar inte en betydande kapacitet för lagring av energi. Istället, de verkar förlita sig på metaboliska interaktioner med angränsande astrocyter, de stora glykogen butikerna i hjärnan5. Det har föreslagits att astrocytic glykogen verkligen spelar en viktig roll för att stödja neuronala energibehov; och ett nyckel fenomen i detta föreslagna neuro-metabolisk koppling mellan de två celltyperna är kapaciteten hos astrocyter att öka deras ATP produktion som svar på neuronala aktivitet6,7,8. Denna hypotes, känd som astrocyte-neuron laktat Shuttle (anls), är fortfarande under debatt, eftersom annat arbete har gett belägg för att nervceller också kan öka sin egen frekvens av glykolys som svar på stimulering9,10, vilket återspeglar nödvändigheten av ytterligare metoder och metoder för att studera neuro-glia interaktion.
Utredning av cellulär energimetabolism och ATP nivåer i nervceller och astrocyter för att belysa neuro-glia metaboliska interaktioner har länge hämmats av avsaknaden av lämpliga sonder för detektion av förändringar i metabolitkoncentrationer i levande celler i hjärnvävnad. Det senaste decenniet har dock gett en ökning av utvecklingen av nya verktyg och nya genetiskt kodade fluorescerande prober för olika metaboliter, inklusive sensorer för ATP, laktat, pyruvat och andra11,12. Med hjälp av dessa verktyg, är det nu möjligt att direkt ta itu med frågor som rör cellulära ATP konsumtion och förändringar i cellulära energi nivåer på enstaka cellnivå och i en cell-typ specifikt sätt i intakt hjärnvävnad13.
I det nuvarande arbetet, beskriver vi ett förfarande för att visualisera cytosoliska ATP dynamik på nervceller och astrocyter av odlade organotypic hjärn skivor. Vi visar hur man använder Adeno-associerade virala vektorer (AAV) för cell-typ specifikt uttryck för den genetiskt kodade ATP-nanosensor ATeam 1,03Yemk (14) i nervceller och astrocyter av skivor av mushjärna som kan upprätthållas i cellkulturen i flera veckor15. Ett förfarande för hur man tar bort den gliaceller ärr som täcker odlade vävnad skivor beskrivs, vilket förbättrar optisk tillgänglighet och avbildning av celler i organotypic vävnad lagren under. Slutligen visar vi hur ATeam 1,03Yemk kan användas för att utföra FRET-baserad avbildning av förändringar i cellulära ATP nivåer i denna beredning. Denna metod är värd de stora fördelarna att det inte kräver kirurgiska hjärnan förfaranden, ger höga nivåer av uttryck av sensorn och celltyp specificitet i odlade hjärn skivor, minska invasivitet eller stress i cellerna jämfört med andra metoder, som transfektion av elektroporation eller transduktion med andra virala vektorer10,16,17. Dessutom kan detta protokoll tillämpas på andra FRET baserade nanosensorer, bland dem varianter av ATeam 1,03 som ger lägre bindning affinitet för ATP14.
Här visar vi ett förfarande för den cell-typ specifika uttryck av ATeam 1,03Yemk, en FRET-baserade, genetiskt kodade nanosensor14, för mätning av förändringar i ATP nivåer i astrocyter eller nervceller i organotypic vävnad slice kulturer av mushjärna15. I exemplariska inspelningar, visar vi att en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen inte resulterar i en förändring i ATP-koncentrationer i nervceller, medan astrocytic ATP nivåer stiger som svar på denna manipulation. Dessutom, våra resultat visar att vid hämning av cellulär metabolism, ATeam 1,03Yemk FRET förhållandet snabbt sjunker i båda celltyper, indikerar en snabb minskning av INTRACELLULÄRA ATP.
Uttryck för ATeam 1,03Yemk i organotypic slice kulturer kräver underhåll av vävnaden i kulturen under kontrollerade betingelser under minst 7-10 dagar. Alternativt kan ATEAM 1,03yemk också användas för mätning av ATP i akut isolerade hjärnvävnad skivor och i optiska nerver av möss13,15. Mätningar i akut isolerad vävnad, dock nödvändiggör generering av transgena djur eller en stereotaktisk tillämpning av virusvektorer i hjärnan, med djurförsök och strikt djuromsorg protokoll. I detta avseende, ATEAM 1,03yemk uttryck i organotypic vävnad slice kulturer representerar ett användbart och värdefullt alternativ22,23. Under många år nu, organotypic vävnad slice kulturer fungera som ett etablerat modellsystem för att studera neurala egenskaper, anslutning och utveckling24,25,26. De upprätthåller inte bara den allmänna vävnads arkitekturen och lamineringen (figur 1), utan också värd för förmåns egenskaperna hos cellkulturer som överlägsen tillgänglighet och direkt kontroll av Försöksförhållanden. Organotypic vävnad slice kulturer är också rutinmässigt används för att uttrycka främmande gener med hjälp av virala vektorer27. Flera typer av virala vektorer har rapporterats att leverera transgener till hjärnvävnad16,28. Adenovirala vektorer inducerar högt uttryck i gliaceller celler, men inte Hippocampus nervceller16, och kan generera gliaceller reaktivitet17. Adeno-associerade virala vektorer som används här framstår som ett bra alternativ15, och deras effektivitet har också visats i vivo29.
Medan främst används för studier av neuronala egenskaper, nyligen genomförda studier har fastställt att organotypic vävnad slice kulturer kan också användas för analys av astrocyter. Odlade skivor är oftast omfattas av ett skikt av reaktiva astrocyter19,30 (figur 5), men astrocyter uppvisar en mer infödd, icke-reaktiv morfologi och cytoarchitecture i djupare skikt19,30 (figur 5). I den nuvarande studien beskriver vi ett förfarande för mekanisk borttagning av den yttre glialärr, vilket resulterar i en bättre experimentell och optisk tillgänglighet av inhemska astrocyter inom rätt organotypic vävnad skikt. Dessutom förbättrar dess avlägsnande uttrycket effektivitet i djupare skikt av organotypic skivor; om glialärr inte avlägsnas, kan transduktion av AAVs tenderar att begränsas till de ytliga cellagren.
Flera yttre mekaniska faktorer måste beaktas när man utför experiment i vävnad skivor. En variation i Bad perfusion hastighet kan inducera rörelser hela preparatet och/eller inducera förändringar i fokus, vilket resulterar i konstgjorda övergående förändringar av sensorn signalen. Dessutom, både astrocyter och nervceller har rapporterats att reagera på mekanisk deformation såsom införts genom höga perfusion priser32,33. I våra händer, med hjälp av en pålitlig Peristaltisk pump, tillsammans med att upprätthålla små och stabila volymer av saltlösning mellan vävnaden och målet (menisken) resulterar i en stabil bandet-signal under baslinjen förhållanden vid perfusion hastighet som används här (1.5-2.5 mL/min; Figur 8).
I den nuvarande studien, visar vi också att FRET-baserad avbildning med ATeam 1,03Yemk kan användas för att övervaka ATP nivåer i nervceller och astrocyter. Ett alternativt sätt som infördes tidigare för mätning av cellulära ATP är den så kallade Luciferin-luciferase assay34,35,36,37. Detta tillvägagångssätt är dock baserat på avbildning av bioluminescens och ger bara en ganska låg tidsmässiga och rumsliga upplösning delvis på grund av höga bakgrundsljud nivåer. En annan metod som rutinmässigt använts under de senaste åren var avbildning av förändringar i den intracellulära magnesium koncentrationen med hjälp av Jon känsliga fluorofore magnesium Green38,39,40. Detta tillvägagångssätt avser iakttagelsen att en konsumtion av ATP resulterar i frisläppandet av dess Co-Factor magnesium. Avbildning med magnesium grönt ger därmed endast en sekundär uppskattning av förändringar i ATP-nivåer. Dessutom är magnesium grön också känslig för förändringar i intracellulära kalcium, införa en annan svårighet när tolka resultat som erhållits med denna metod.
Den senaste utvecklingen av genetiskt kodade nanosensorer för direkt avbildning av cellulära metaboliter, därför representerade ett stort steg framåt11,12. Flera olika sensorer genererades som kan användas för mätning av intracellulära ATP36,41,42,43. Bland dessa är den ratiometriska fluorescerande ATP indikatorn “drottning”41 samt PercevalHR, som känner av ATP: ADP ratio42. Medan den sistnämnda sonden är ett värdefullt verktyg för att studera cellernas energistatus krävs samtidig mätning av förändringar i pH42.
ATeam är en nanosensor där flera varianter finns, vilka bland annat skiljer sig åt i deras bindningsaffinitet för ATP-14. In vitro, ATEAM 1,03yemk uppvisar en Kd på 1,2 mm vid 37 ° c, som är nära cellulära ATP nivåer bestäms i olika neuronala celltyper, allt från hypotalamus och lillhjärnan34 till Hippocampus37,44,45. I kyvetten mätningar, sänka temperaturen med 10 ° c resulterade i en signifikant minskning av bindningsaffinitet av ATEAM 1,03yemk till ATP, vilket tyder på att det kanske inte är idealisk för cellulära Imaging vid rumstemperatur14. Vår tidigare studie15, emellertid, visade att beteendet och svaret av ATEAM 1,03yemk uttrycks i nervceller och astrocyter till olika manipulationer är liknande på nära fysiologiska och vid rumstemperatur, vilket indikerar att sensorn tillåter tillförlitlig bestämning av intracellulära ATP nivåer under båda förhållanden. Dessutom, våra tidigare experiment riktat pH-känslighet ATeam 1,03Yemk uttrycks inuti celler15, visar att det är okänsligt för förändringar i intracellulära pH med ca 0,1-0,2 pH-enheter. Om Kd i den låga mm-serien är ett bekymmer, alternativa ATEAM varianter kan användas14, bland dem röd-skiftade varianter av ATEAM (“go-ateam”)43.
Våra experiment med ATeam 1,03yemk visar att en ökning av den extracellulära kaliumkoncentrationen med några mm endast (från 3 till 8 mm) resulterar i en övergående ökning av ATEAM 1,03yemk förhållandet i astrocyter i organotypic slice kultur. Denna observation bekräftar tidigare studier15,46 och visar tydligt att astrocyter svara på frisättning av kalium genom aktiva nervceller med en ökning av deras ATP produktion, mest sannolikt som en följd av en stimulering av na+/k+-ATPas och na+/HCO3– cotransporter, respektive47,48. I motsats till detta, nervceller visade inte ett svar, som är i linje med tidigare arbete samt15. Båda celltyperna, dock, snabbt och starkt reagerade på hämning av cellulär glykolys och mitokondriell andning som visas före15. Under förhållanden av kemisk ischemia, ATeam FRET nyckeltal föll till en ny stabil nivå, vilket indikerar en nominell utarmning av cellulära ATP. Det senare resultatet tyder på att både nervceller samt astrocyter uppvisar en relevant konsumtion av ATP även under steady-state villkor utan ytterligare stimulering av synaptisk aktivering eller tillämpning av signalsubstanser. Sammantaget drar vi slutsatsen att FRET-baserad avbildning med genetiskt kodade nanosensorer, bland dem ATeam 1,03Yemk, kommer att ge en värdefull strategi för att belysa de cellulära processer som är ansvariga för förändringar i intracellulära ATP nivåer och cellulära ATP konsumtion under olika förhållanden.
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Claudia Roderigo och Simone Durry för expert teknisk assistans. Vi tackar Dr. Niklas J. Gerkau och M.Sc. Joel Nelson för hjälp med att förbereda de organotypiska segment kulturerna. Forskning i författarens laboratorium finansierades av den tyska forskningsföreningen (DFG; FÖR 2795: ro 2327/13-1 och SPP 1757: ro 2327/8-2 till CRR; och SPP 1757: unga glia start finansiering till RL).
2-deoxyglucose | Alfa Aesar | L07338 | Non-metabolizable glucose analog |
36-IMA-410-019 Argon laser | Melles Griot | 488 nm wavelength argon | |
Ascorbic acid | Carl Roth | 3525.1 | Antioxidant, Vitamin C |
band pass filters 483/32 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
band pass filters 542/27 | AHF Analysentechnik AG | Splitter compatible emmision filter | |
Beamsplitter T 455 LP | AHF Analysentechnik AG | Excitation dichroic mirror | |
Beamsplitter T 505 LPXR | AHF Analysentechnik AG | Splitter dichroic | |
Confocal laser scannig microscope C1 | Nikon Microscope Solutions | Modular confocal microscope system C1 | |
Data processing Origin Pro 9.0.0 (64-bit) | OriginLab corporation | Scientific graphing and data analysis software | |
D-glucose monohydrate | Caelo | 2580-1kg | |
DPBS | GIBCO/Life | 14190250 | Dulbecco's phosphate-buffered saline |
Eclipse E 600FN upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Eclipse FN1 upright microscope | Nikon Microscope Solutions | ||
Experimental chamber | custom build | Perfusion chamber for live-cell imaging | |
EZ-C1 Silver Version 3.91 | Nikon Microscope Solutions | Imaging software for confocal microscope | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma-Aldrich | H9394 | With Phenol Red for pH monitoring |
HERAcell 150 | Thermo Scientific | CO2 incubator HERAcell ® 150 with decontamination routine | |
HERAsafe KS/KSP | Thermo Scientific | Safety Cabinet | |
Horse serum | GIBCO/Life | 26050088 | Heat inactivated |
Huygens Professional | SVI Imaging | Deconvolution software | |
Image J 1.52i | Wayne Rasban national Institute of Health | Image processing Software available in the public domain | |
Insulin | Sigma-Aldrich | I6634 | Insulin from bovine pancreas |
IP serie peristaltic pump | Ismatec | High-precisionmulti-channel pump | |
Layout software, Illustrator CS6 | Adobe | Vector graphics editor | |
L-glutamine | GIBCO/Life | 25030024 | |
Microm HM 650 V | Thermo Scientific | Vibration microtome. Thermo scientific discontinued the production of the device in the meantime. Any other slicer or tissue chopper siutable for slicing living tissue is fine, too. | |
Microscope stage | custom build | ||
Microsoft Excel 16 | Microsoft | Spreadsheet software for basic data processing | |
Millicell culture insert | Merck Millipore | PICM0RG50 | Hydrophilized PTFE, pore size 0.4 μm |
Minimum Essential Medium Eagle | Sigma-Aldrich | M7278 | Synthetic cell culture media |
Monochromator Polychrome V | Thermo Scientific/FEI | Ultra fast switching monochromator | |
NaN3 (Sodium Azide) | Sigma-Aldrich | S-8032 | Mitochondrial inhibitor (complex IV inhibitor). CAUTION: Azide is toxic. Be aware not to accidentally ingest or inhale it, and prevent ist absoption through the skin. |
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0 | Nikon Microscope Solutions | Water Immersion Microscope Objective | |
NIS Elements 4.50 advanced Research | Nikon Microscope Solutions | Imaging software. Upgraded version for FRET imaging | |
ORCA-Flash4.0 | Hamamatsu Photonics | Digital CMOS camera | |
Perfusion tubing | Pro Liquid GmbH | Tygon tubing, 1.52 x 322 mm (Wd: 0.85) | |
Photoshop CS 6 Version 13.0 | Adobe | Image processing software | |
Sodium L-lactate | Sigma-Aldrich | 71718-10G | |
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A) | ETH Zürich | v244 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human synapsin 1 promoter fragment hSyn1. |
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A) | ETH Zürich | v307 | Single-stranded AAV vector that induces the expression of ATeam1.03YEMK under the control of the human glial fibrillary acidic protein promoter fragment ABC1D. |
WVIEW GEMINI optic system | Hamamatsu Photonics | Emission Image Splitter |