Migrations, Chemo-Attraction et Co-Culture Assays for Human Stem Cell-Derived Endothelial Cells and GABAergic Neurons (en anglais)

Summary

Nous présentons trois essais in vitro simples -l’analyse de migration à longue distance, l’analyse de migration de co-culture, et l’analyse de chimio-attraction–qui évaluent collectivement les fonctions des cellules souches humaines dérivées des cellules périventriculaires endothéliales et de leur interaction avec les interneurons GABAergic.

Abstract

Le rôle de la vascularisation du cerveau dans le développement du système nerveux et l’étiologie des troubles cérébraux attire de plus en plus l’attention. Nos études récentes ont identifié une population spéciale de cellules vasculaires, les cellules endothéliales periventriculaires, qui jouent un rôle critique dans la migration et la distribution des interneurones GABAergic avant-cerveau pendant le développement embryonnaire. Ceci, couplé avec leurs fonctions cellulaires-autonomes, fait allusion à de nouveaux rôles des cellules endothéliales periventriculaires dans la pathologie des désordres neuropsychiatriques comme la schizophrénie, l’épilepsie, et l’autisme. Ici, nous avons décrit trois essais in vitro différents qui évaluent collectivement les fonctions des cellules endothéliales periventriculaires et leur interaction avec les interneurons GABAergic. L’utilisation de ces tests, en particulier dans un contexte humain, nous permettra d’identifier le lien entre les cellules endothéliales periventriculaires et les troubles cérébraux. Ces essais sont simples, peu coûteux et reproductibles, et peuvent être facilement adaptés à n’importe quel type de cellule adhérente.

Introduction

Les cellules endothéliales forment la muqueuse des vaisseaux sanguins et les fonctions importantes de médiation qui incluent le maintien de la perméabilité de mur de vaisseau, la régulation du flux sanguin, l’agrégation de plaquette, et la formation de nouveaux vaisseaux sanguins. Dans le cerveau, les cellules endothéliales font partie d’une barrière hémato-encéphalique critique qui contrôle étroitement l’échange de matériaux entre le cerveau et la circulation sanguine¹. Nos études dans la dernière décennie ont identifié de nouveaux rôles neurogènes des cellules endothéliales de cerveau qui ont des implications significatives pour le développement et le comportement de cerveau^2,3,4,5. Nous avons montré que le cerveau embryonnaire de souris est vascularisé par deux sous-types distincts des navires, les vaisseaux pial et les vaisseaux périventriculaires, qui diffèrent dans l’anatomie, l’origine, et le profil développemental^2. Les cellules endothéliales qui tapissent ces deux sous-types de vaisseaux présentent des différences distinctes dans leurs profils d’expression génique. Tandis que les cellules endothéliales piales expriment principalement des gènes liés à l’inflammation et à la réponse immunitaire, les cellules endothéliales periventriculaires sont uniquement enrichies dans l’expression des gènes généralement associés à la neurogenèse, à la migration neuronale, à la chimiotaxie, et au guidage d’axone^3. Les cellules endothéliales periventriculaires abritent également une nouvelle voie de signalisation DE GABA qui est distincte de la voie neuronale traditionnelle de signalisation de GABA^5. En même temps que son expression génique, des cellules endothéliales periventriculaires ont été trouvées pour réguler la migration et la distribution des interneurons GABAergic dans le néocortex en développement. Pendant le développement embryonnaire, les cellules endothéliales periventriculaires subissent la migration à longue distance le long d’un gradient ventral-dorsal pour établir le réseau vasculaire periventriculaire^2,3. Cette route migratoire est reflétée un jour plus tard par des interneurones. Les interneurones migrateurs interagissent physiquement avec le réseau vasculaire périventriculaire préformé et l’utilisent comme guide pour atteindre leur destination finale dans le néocortex. En plus d’agir comme substrat physique, les cellules endothéliales périventriculaires servent de source de repères de navigation pour les neurones migrateurs. Periventricular endothelial cell-secreted GABA guide la migration interneuron et régule leurs modèles de distribution finale⁴. Les défauts dans la migration et la distribution interneuron sont associés aux désordres neuropsychiatriques tels que l’autisme, l’épilepsie, la schizophrénie et la dépression^6,7,8,9,10. Par conséquent, l’étude des fonctions endothéliales periventriculaires de cellules et de leur influence sur la migration interneuron dans le contexte humain devient critique pour adresser la pathogénie de ces désordres.

Nous avons généré des cellules endothéliales periventriculaires humaines à partir de cellules souches embryonnaires humaines dans notre laboratoire¹¹, en utilisant la technologie induite des cellules souches pluripotentes (iPSC)^12,13. Pour valider si les cellules endothéliales periventriculaires humaines imitent fidèlement les cellules endothéliales periventriculaires de souris, et pour évaluer quantitativement leur influence sur la migration interneuron, nous avons développé trois essais in vitro : un essai de migration à longue distance, un essai de migration de co-culture, et un essai de chimio-attraction. Ici, nous décrivons les protocoles pour ces essais en détail. Les trois essais sont basés sur l’utilisation d’inserts de culture de silicone pour créer un petit patch rectangulaire de cellules (de dimensions fixes) entouré s’un de l’espace sans cellules. La distance de migration est évaluée en mesurant la distance entre les positions finales des cellules à partir de la bordure de la plaque rectangulaire qui a été décrite le jour 0. Dans l’essai de migration à longue distance, les cellules endothéliales periventriculaires humaines sont enseventées comme un patch au centre d’un plat de 35 mm, et les distances parcourues par les cellules sur une longue période de temps sont calculées. Dans l’essai de migration de co-culture, les cellules endothéliales periventriculaires humaines sont co-enseçantes avec des interneurons humains comme un patch dans un plat de 35 mm. Cette configuration permet d’examiner l’effet des interactions physiques directes de ces deux types de cellules sur le taux de migration des interneurones. L’exemple de chimio-attraction mesure la migration des interneurones en réponse aux indices chimio-attrayants sécrétés par les cellules endothéliales periventriculaires humaines. Les interneurones sont ensedus comme un patch rectangulaire, avec des cellules endothéliales periventriculaires humaines et contrôlent les cellules endothéliales non periventriculaires ensevulées comme des taches de taille similaire de chaque côté. Chacune des plaques cellulaires est séparée par un espace sans cellules de 500 m. La réponse des interneurones est évaluée en quantifiant le nombre de cellules qui ont migré vers les cellules endothéliales periventriculaires par rapport au contrôle des cellules endothéliales non perventriculaires.

Ces essais fournissent l’évaluation robuste des fonctions endothéliales periventriculaires humaines de cellules et de leur influence sur la migration interneuron. La nouvelle configuration de l’analyse longue distance et de l’analyse de la migration par co-culture fournit un espace libre de cellules dans la gamme de centimètres (1-1,5 cm) pour permettre la détection de la migration à longue distance. Un résumé des caractéristiques de nos essais par rapport à d’autres essais populaires est présenté dans le tableau 1. Collectivement, les essais décrits ici serviront de plate-forme pour évaluer les cellules endothéliales periventriculaires « malades » et les interneurons générés par les iPSC des désordres de cerveau comme la schizophrénie, l’autisme ou l’épilepsie. Ces essais peuvent également être utilisés pour déterminer comment différentes conditions (p. ex. inhibiteurs, ligands, ARNi) affectent la migration cellulaire. Enfin, ces tests peuvent être optimisés pour d’autres types de cellules afin de mesurer la migration à longue distance, la chimio-attraction ou la migration par mediated cellule-cell.

Protocol

1. Culture et stockage des cellules endothéliales periventriculaires humaines Maintenir les cellules endothéliales periventriculaires humaines sur la matrice de membrane du sous-sol (voir Tableau des matériaux)plaques de 6 puits dans le milieu cellulaire endothélial periventriculaire (milieu E6 contenant 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 et 5 M GABA) à 37 oC et 5 % CO2. Changer de moyen tous les jours alternatifs. Décongeler la matrice de membrane du sous-sol en 4 oC et…

Representative Results

Les étapes pour mettre en place un insert de culture d’un puits à l’intérieur d’un plat de 35 mm sont indiquées dans la figure 1. L’assay de migration à longue distance et l’assay de migration de co-culture ont utilisé un insert d’un puits pour ensemencer le nombre désiré de cellules au centre d’un plat de 35 mm enduit de poly-L-ornithine/laminin. Le jour 0, les cellules étaient présentes sous forme de patch rectangulaire(figure…

Discussion

Ici, nous avons décrit trois essais in vitro qui fournissent ensemble l’évaluation quantitative des propriétés endothéliales endothéliales humaines de cellules-spécifiques. Ces essais seront utiles pour obtenir des connaissances mécanistes sur l’interaction des cellules endothéliales periventriculaires humaines avec les interneurones humains. Des expériences utilisant des ligands, des inhibiteurs ou des cellules présentant un renversement ou une surexpression spécifique au gène identifieront ou valideront de…

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100