Migrazione, chemio-attrazione, e analisi co-cultura per le cellule endoteliali derivate da cellule staminali umane e neuroni GABAergic

Summary

Vi presentiamo tre semplici saggi in vitro: il saggio di migrazione a lunga distanza, il saggio di co-cultura sulla migrazione e l’analisi chemio-attrazione-che valutano collettivamente le funzioni delle cellule staminali umane derivate cellule endoteliali periventricolari e le loro interazione con gli interneuroni GABAergic.

Abstract

Ruolo della vascolatura cerebrale nello sviluppo del sistema nervoso e nell’eziologia dei disturbi cerebrali sta guadagnando sempre più attenzione. I nostri studi recenti hanno identificato una popolazione speciale di cellule vascolari, le cellule endoteliali periventricolari, che svolgono un ruolo fondamentale nella migrazione e distribuzione di interneuroni GABAergici del prosencefalo cerebrale durante lo sviluppo embrionale. Questo, unito alle loro funzioni autonome alle cellule, allude a nuovi ruoli di cellule endoteliali periventricolari nella patologia dei disturbi neuropsichiatrici come la schizofrenia, l’epilessia e l’autismo. Qui, abbiamo descritto tre diversi saggi in vitro che valutano collettivamente le funzioni delle cellule endoteliali periventriculari e la loro interazione con gli interneuroni GABAergici. L’uso di questi saggi, in particolare in un contesto umano, ci permetterà di identificare il legame tra le cellule endoteliali periventricolari e i disturbi cerebrali. Questi saggi sono semplici, a basso costo e riproducibili e possono essere facilmente adattati a qualsiasi tipo di cellula aderente.

Introduction

Le cellule endoteliali formano il rivestimento dei vasi sanguigni e mediano importanti funzioni che includono il mantenimento della permeabilità della parete del vaso, la regolazione del flusso sanguigno, l’aggregazione delle piastrine e la formazione di nuovi vasi sanguigni. Nel cervello, le cellule endoteliali fanno parte di una barriera emato-encefalica critica che controlla strettamente lo scambio di materiali tra il cervello e il flusso sanguigno¹. I nostri studi nell’ultimo decennio hanno identificato nuovi ruoli neurogenici delle cellule endoteliali cerebrali che hanno implicazioni significative per lo sviluppo e il comportamento del cervello^2,3,4,5. Abbiamo dimostrato che il prosencefalo embrionale del topo è vascolarizzato da due distinti sottotipi di vasi, i vasi di pial e i vasi periventricolari, che differiscono per anatomia, origine e profilo di sviluppo². Le cellule endoteliali che rivestono questi due sottotipi di vasi mostrano differenze distinte nei loro profili di espressione genica. Mentre le cellule endoteliali piale esprimono per lo più geni legati all’infiammazione e alla risposta immunitaria, le cellule endoteliali periventricolari sono arricchite in modo univoco nell’espressione di geni comunemente associati a neurogenesi, migrazione neuronale, chemiotassi e guida degli assoni³. Le cellule endoteliali periventriculari ospitano anche un nuovo percorso di segnalazione GABA che è distinto dal tradizionale percorso di segnalazione neuronale GABA⁵. Concomitante con la sua espressione genica, sono state trovate cellule endoteliali periventricolari per regolare la migrazione e la distribuzione di interneuroni GABAergici nella neocorteccia in via di sviluppo. Durante lo sviluppo embrionale, le cellule endoteliali periventriculari subiscono una migrazione a lunga distanza lungo un gradiente ventrale-dorsale per stabilire la rete vascolare periventricolare^2,3. Questa rotta migratoria si rispecchia un giorno dopo dagli interneuroni. Gli interneuroni che migrano interagiscono fisicamente con la rete vascolare periventricolare preformata e la usano come guida per raggiungere la loro destinazione finale nella neocorteccia. Oltre ad agire come substrato fisico, le cellule endoteliali periventricolari servono come fonte di segnali di navigazione per i neuroni che migrano. Guide endotiliariche GABA semeggiate da cellule interneuroni e regola i loro schemi di distribuzione finale⁴. I difetti nella migrazione e distribuzione di interneuroni sono associati a disturbi neuropsichiatrici come autismo, epilessia, schizofrenia e depressione^6,7,8,9,10. Pertanto, lo studio delle funzioni endoteliali periventricolari e la loro influenza sulla migrazione interneurone nel contesto umano diventa fondamentale per affrontare la patogenesi di questi disturbi.

Abbiamo generato cellule endoteliali periventricolari umane da cellule staminali embrionali umane nel nostro laboratorio¹¹, utilizzando la tecnologia indotta di cellule staminali pluripotenti (iPSC)^12,13. Per verificare se le cellule endoteliali periventriculari umane imitano fedelmente le cellule endoteliali periventricolari del topo e per valutare quantitativamente la loro influenza sulla migrazione interneurone, abbiamo sviluppato tre saggi in vitro: un saggio di migrazione a lunga distanza, un test di migrazione co-culturale e un’attrazione chemio-attrazione. Qui descriviamo i protocolli per questi saggi in dettaglio. Tutti e tre i saggi si basano sull’uso di inserti di coltura del silicone per creare una piccola patch rettangolare di celle (di dimensioni fisse) circondate da spazio senza celle. La distanza di migrazione viene valutata misurando la distanza tra le posizioni finali delle celle dal bordo della patch rettangolare che è stata delineata il giorno 0. Nel test sulla migrazione a lunga distanza, le cellule endoteliali periventricolari umane vengono semimate come patch al centro di un piatto di 35 mm e vengono calcolate le distanze percorse dalle cellule per un lungo intervallo di tempo. Nel saggio di migrazione co-culturale, le cellule endoteliali periventranti umane sono co-semiseme con interneuroni umani come una patch in un piatto da 35 mm. Questa configurazione consente di esaminare l’effetto delle interazioni fisiche dirette di questi due tipi di cellule sul tasso di migrazione degli interneuroni. Il saggio chemio-attrazione misura la migrazione degli interneuroni in risposta a segnali chemio-attraenti secreti dalle cellule endoteliali periventriculari umane. Gli interneuroni sono semi come una macchia rettangolare, con cellule endoteliali periventrapicolari umane e controllano le cellule endoteliali non periventriculari come cerotti di dimensioni simili su entrambi i lati. Ciascuna delle patch cellulari è separata da uno spazio privo di cellule di 500 m. La risposta degli interneuroni viene valutata quantificando il numero di cellule migrate verso cellule endoteliali periventricolari rispetto al controllo delle cellule endoteliali non periventricolari.

Questi saggi forniscono una solida valutazione delle funzioni endoteliali periventricolari umane e della loro influenza sulla migrazione degli interneuroni. La nuova configurazione del saggio a lunga distanza e della analisi della migrazione co-culturale fornisce uno spazio senza cellule nell’intervallo di centimetri (1-1,5 cm) per consentire il rilevamento della migrazione a lunga distanza. Una sintesi delle caratteristiche dei nostri saggi rispetto ad altri saggi popolari è presentata nella Tabella 1. Collettivamente, i saggi qui descritti serviranno come piattaforma per valutare le cellule endoteliali periventricolari “malattie” e gli interneuroni generati da iPSC di disturbi cerebrali come la schizofrenia, l’autismo o l’epilessia. Questi saggi possono anche essere utilizzati per determinare in che modo le diverse condizioni (ad esempio inibitori, ligando, RNAi) influenzano la migrazione cellulare. Infine, questi saggi possono essere ottimizzati per altri tipi di cellule per misurare la migrazione a lunga distanza, la chemio-attrazione o la migrazione mediata cellulare.

Protocol

1. Cultura e conservazione delle cellule endoteliali umane Mantenere le cellule endoteliali periventricolari umane su una matrice a membrana sotterranea rivestita a matrice (vedi Tabella dei materiali)di 6 pozzetti in mezzo a cellule endoteliali periventricolari (mezzo E6 contenente 50 ng/mL VEGF-A, 100 ng/mL FGF2 e 5 gannive GABA) a 37 gradi centigradi e 5% di CO2. Cambia mezzo ogni giorno alternativo. Scongelare la matrice della membrana del seminterrato a 4 gradi centigr…

Representative Results

I passaggi per impostare un inserto di coltura a un solo pozzo all’interno di un piatto da 35 mm sono illustrati nella Figura 1. L’analisi della migrazione a lunga distanza e il test sulla migrazione co-culturale hanno utilizzato un inserto monogrado per sedare il numero desiderato di cellule al centro di un piatto rivestito di poli-L-ornina/laminina 35 mm. Il giorno 0, le celle erano presenti come patch rettangolare (Figura 2<st…

Discussion

Qui, abbiamo descritto tre saggi in vitro che insieme forniscono una valutazione quantitativa delle proprietà endoteliali periventriculari umane. Questi saggi saranno preziosi per ottenere intuizioni meccanicistiche sull’interazione delle cellule endoteliali periventriculari umane con gli interneuroni umani. Gli esperimenti che utilizzano ligandi, inibitori o cellule con knockdown o sovraespressione specifici del gene identificheranno o convalideranno i giocatori molecolari che mediano la migrazione di interneuroni guid…

Materials

Accutase dissociation solution	Millipore Sigma	SCR005	Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4)
Anti-human β-Tubulin antibody	Biolegend	802001
Anti-human CD31 antibody	Millipore Sigma	CBL468
Anti- MAP2 antibody	Neuromics	CH22103
Anti-active Caspase 3 antibody	Millipore Sigma	AB3623
Control human endothelial cells	Cellular Dynamics	R1022
Control endothelial Cells Medium Supplement	Cellular Dynamics	M1019
Cryogenic vials	Fisher Scientific	03-337-7Y
DMEMF/12 medium	Thermofisher Scientific	11320033
DMSO	Sigma-Aldrich	D2650
E6 medium	Thermofisher Scientific	A1516401
FGF2	Thermofisher Scientific	PHG0261
Fibronectin	Thermofisher Scientific	33016-015
Freezing Container	Thermofisher Scientific	5100
GABA	Sigma-Aldrich	A2129
Hemacytometer	Sigma-Aldrich	Z359629
Human GABAergic neurons	Cellular Dynamics	R1013
Human GABAergic neurons base medium	Cellular Dynamics	M1010
Human GABAergic neuron Neural supplement	Cellular Dynamics	M1032
Laminin	Sigma	L2020
Matrigel	Corning	356230	Basement membrane matrix
Mounting Medium	Vector laboratories	H-1200
poly-L-ornithin	Sigma	p4957
PBS	Thermofisher Scientific	14190
Trypan blue	Thermofisher Scientific	15250061
TrypLE	Thermofisher Scientific	12563011	Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4)
VEGF-A	Peprotech	100-20
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	Lifeline Cell Technologies	LL-0003	Component of control human endothelial cell medium
2-well silicone culture-Insert	ibidi	80209
3-well silicone culture-Insert	ibidi	80369
35 mm dish	Corning	430165
15-ml conical tube	Fisher Scientific	07-200-886
4% PFA solution	Fisher Scientific	AAJ19943K2
6-well tissue culture plate	Fisher Scientific	14-832-11
Inverted phase contrast microscope	Zeiss	Zeiss Axiovert 40C
Fluorescent microscope	Olympus	FSX-100