Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için
Summary
Biz üç basit in vitro tahliller-uzun mesafe göç tahlil, co-kültür göç tahlil ve kemo-attraction tahlil-topluca insan kök hücre perisiyitli endotel hücreleri ve bunların işlevlerini değerlendirmek GABAerjik internöronlar ile etkileşim.
Abstract
Beyin hastalıklarının sinir sistemi gelişiminde ve etiyolojisinde beyin vaskülatürünün rolü giderek daha fazla dikkat çekmaktadır. Bizim son çalışmalar vasküler hücrelerin özel bir popülasyon tespit ettik, periventriküler endotel hücreleri, embriyonik gelişim sırasında ön beyin GABAerjik internöronların göçü ve dağılımında kritik bir rol oynamaktadır. Bu, hücre özerk fonksiyonları ile birleştiğinde, şizofreni, epilepsi ve otizm gibi nöropsikiyatrik bozuklukların patolojiperiventriküler endotel hücrelerinin yeni rolleri ima eder. Burada, biz topluca periventriküler endotel hücrelerinin fonksiyonlarını ve GABAerjik internöronlar ile etkileşimini değerlendirmek üç farklı in vitro tahliller tarif ettik. Bu tahlillerin, özellikle de insan bağlamında kullanılması, periventriküler endotel hücreleri ile beyin bozuklukları arasındaki bağlantıyı belirlememize olanak sağlayacaktır. Bu tahliller basit, düşük maliyetli ve tekrarlanabilir ve herhangi bir bağlı hücre türüne kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Endotel hücreleri kan damarlarının astarı oluşturur ve damar duvarı geçirgenliğinin sürdürülmesi, kan akışının düzenlenmesi, trombosit agregasyonu ve yeni kan damarlarının oluşumu nu içeren önemli işlevlere aracılık eder. Beyinde, endotel hücreleri sıkı beyin ve kandolaşımı1 arasındaki malzeme alışverişini sıkı bir şekilde kontrol kritik bir kan-beyin bariyerinin bir parçası nı oluşturur. Sonon yılda çalışmalarımız beyin gelişimi vedavranışı2,3,4,5için önemli etkileri olan beyin endotel hücrelerinin yeni nörojenik rolleri tespit var. Biz fare embriyonik ön beynin damarların iki farklı alt tipleri, pial damarlar ve periventriküler damarlar, anatomi farklı tarafından vaskülarize olduğunu göstermiştir, kökeni, ve gelişimprofili2. Bu iki damar alt tipini kaplayan endotel hücreleri gen ekspresyonu profillerinde belirgin farklılıklar göstermektedir. Pial endotel hücreleri çoğunlukla inflamasyon ve immün yanıt ile ilgili genleri ifade ederken, periventriküler endotel hücreleri yaygın nörogenez, nöronal göç, kemotaksis ve akson rehberlik ile ilişkili genlerin ekspresyonu nda benzersiz zenginleştirilmiş3. Periventriküler endotel hücreleri de geleneksel nöronal GABA sinyal yolu farklı bir yeni GABA sinyal yolu ev5. Gen ekspresyonu ile birlikte, periventriküler endotel hücreleri gelişmekte olan neokortekste GABAerjik internöronların göçünü ve dağılımını düzenleyen bulunmuştur. Embriyonik gelişim sırasında, periventriküler endotel hücreleri periventriküler vasküler ağ kurmak için bir ventral-dorsal gradyan boyunca uzun mesafe göç geçmesi2,3. Bu göç yolu bir gün sonra internöronlar tarafından yansıtılır. Göç eden internöronlar önceden oluşturulmuş periventriküler vasküler ağ ile fiziksel olarak etkileşime girerek neokorteksteki son hedeflerine ulaşmak için bir kılavuz olarak kullanırlar. Fiziksel bir substrat olarak hareket ek olarak, periventriküler endotel hücreleri göç nöronlar için navigasyon ipuçları kaynağı olarak hizmet vermektedir. Periventriküler endotel hücre salgılanan GABA internöron göç kılavuzları ve son dağılım desenleri düzenler4. İnternöron göçü ve dağılımındaki bozukluklar otizm, epilepsi, şizofreni ve depresyon gibi nöropsikiyatrik bozukluklarla ilişkilidir6,7,8,9,10. Bu nedenle, periventriküler endotel hücre fonksiyonlarının incelenmesi ve insan bağlamında internöron göçü üzerindeki etkileri bu bozuklukların patogenezi ele almak için kritik hale gelir.
Biz laboratuvar11insan embriyonik kök hücrelerinden insan periventriküler benzeri endotel hücreleri ürettik , indüklenen pluripotent kök hücre kullanarak (iPSC) teknolojisi12,13. İnsan periventriküler endotel hücrelerinin fare periventriküler endotel hücrelerini sadakatle taklit edip etmediğini doğrulamak ve internöron göçü üzerindeki etkilerini nicel olarak değerlendirmek için üç in vitro tahlil geliştirdik: uzun mesafeli göç tahlilleri, ortak kültür göç tahlilleri ve bir kemo-attraction tahlil. Burada ayrıntılı olarak bu tahliller için protokolleri açıklar. Her üç tahliller hücre-serbest alan ile çevrili hücrelerin küçük bir dikdörtgen yama (sabit boyutlarda) oluşturmak için silikon kültür eklerin kullanımına dayanmaktadır. Göç mesafesi, 0. Uzun mesafeli göç testinde, insan periventriküler endotel hücreleri 35 mm’lik bir kabın ortasında yama olarak tohumlanır ve hücrelerin uzun bir zaman aralığında kat ettiği mesafeler hesaplanır. Eş-kültür göç analizinde, insan periventriküler endotel hücreleri 35 mm çanak bir yama olarak insan internöronlar ile birlikte tohumlu. Bu kurulum, bu iki hücre türünün doğrudan fiziksel etkileşimlerinin internöronların geçiş hızı üzerindeki etkisinin incelenmesini sağlar. Kemo-attraction test insan periventriküler endotel hücreleri tarafından salgılanan kemo-çekici ipuçlarıyanıt olarak internöronlerin göç ölçer. İnternöronlar dikdörtgen yama olarak tohumlanır, insan periventriküler endotel hücreleri ile ve kontrol olmayan periventriküler endotel hücreleri her iki tarafta benzer büyüklükte yamalar olarak tohumlu. Hücre yamaları her biri 500 μm hücresiz bir boşluk ile ayrılır.
Bu tahliller insan periventriküler endotel hücre fonksiyonları ve internöron göçü üzerindeki etkileri sağlam bir değerlendirme sağlar. Uzun mesafe lisyon analizi ve ortak kültür göç analizinin yeni kurulumu, uzun mesafeli göçün algılanmasına olanak sağlamak için santimetre (~1-1,5 cm) aralığında hücresiz alan sağlar. Diğer popüler tahlillere göre tahlillerimizin özelliklerinin bir özeti Tablo 1’desunulmuştur. Topluca, burada açıklanan tahliller şizofreni, otizm veya epilepsi gibi beyin bozukluklarının inpscs oluşturulan “hastalıklı” periventriküler endotel hücreleri ve internöronlar değerlendirmek için bir platform olarak hizmet edecektir. Bu tahliller aynı zamanda farklı koşulların (örn. inhibitörler, ligandlar, RNAi) hücre göçlerini nasıl etkilediğini belirlemek için de kullanılabilir. Son olarak, bu tahliller uzun mesafe göç, kemo-attraction veya hücre-hücre aracılı geçiş ölçmek için diğer hücre türleri için optimize edilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, birlikte insan periventriküler endotel hücreye özgü özelliklerinin nicel değerlendirmesini sağlayan üç in vitro tahlilleri tanımladık. Bu tahliller insan periventriküler endotel hücrelerinin insan internöronları ile etkileşimi içine mekanistik anlayışlar kazanıyor değerli olacaktır. Ligandlar, inhibitörler veya gen-spesifik nakavt veya aşırı ekspresyon ile hücreleri kullanarak deneyler tespit edecek veya endotel hücre güdümlü internöron göç veya periventriküler endotel hücreler…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Ulusal Ruh Sağlığı Enstitüsü (R01MH110438) ve Ulusal Nörolojik Bozukluklar ve İnme Enstitüsü ‘nün (R01NS100808) AV’ye verdiği ödüllerle desteklenmiştir.
Materials
| Accutase dissociation solution | Millipore Sigma | SCR005 | Cell dissociation solution (for periventricular endothelial cells, step 1.4) |
| Anti-human β-Tubulin antibody | Biolegend | 802001 | |
| Anti-human CD31 antibody | Millipore Sigma | CBL468 | |
| Anti- MAP2 antibody | Neuromics | CH22103 | |
| Anti-active Caspase 3 antibody | Millipore Sigma | AB3623 | |
| Control human endothelial cells | Cellular Dynamics | R1022 | |
| Control endothelial Cells Medium Supplement | Cellular Dynamics | M1019 | |
| Cryogenic vials | Fisher Scientific | 03-337-7Y | |
| DMEMF/12 medium | Thermofisher Scientific | 11320033 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| E6 medium | Thermofisher Scientific | A1516401 | |
| FGF2 | Thermofisher Scientific | PHG0261 | |
| Fibronectin | Thermofisher Scientific | 33016-015 | |
| Freezing Container | Thermofisher Scientific | 5100 | |
| GABA | Sigma-Aldrich | A2129 | |
| Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | |
| Human GABAergic neurons | Cellular Dynamics | R1013 | |
| Human GABAergic neurons base medium | Cellular Dynamics | M1010 | |
| Human GABAergic neuron Neural supplement | Cellular Dynamics | M1032 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Matrigel | Corning | 356230 | Basement membrane matrix |
| Mounting Medium | Vector laboratories | H-1200 | |
| poly-L-ornithin | Sigma | p4957 | |
| PBS | Thermofisher Scientific | 14190 | |
| Trypan blue | Thermofisher Scientific | 15250061 | |
| TrypLE | Thermofisher Scientific | 12563011 | Cell dissociation solution (for GABAergic interneurons and endothelial cells, sections 3 and 4) |
| VEGF-A | Peprotech | 100-20 | |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | Lifeline Cell Technologies | LL-0003 | Component of control human endothelial cell medium |
| 2-well silicone culture-Insert | ibidi | 80209 | |
| 3-well silicone culture-Insert | ibidi | 80369 | |
| 35 mm dish | Corning | 430165 | |
| 15-ml conical tube | Fisher Scientific | 07-200-886 | |
| 4% PFA solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| 6-well tissue culture plate | Fisher Scientific | 14-832-11 | |
| Inverted phase contrast microscope | Zeiss | Zeiss Axiovert 40C | |
| Fluorescent microscope | Olympus | FSX-100 |
Riferimenti
- Sweeney, M. D., Zhao, Z., Montagne, A., Nelson, A. R., Zlokovic, B. V. Blood-Brain Barrier: From Physiology to Disease and Back. Physiological Reviews. 99 (1), 21-78 (2019).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nature Neuroscience. 11 (4), 429-439 (2008).
- Won, C., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nature Communications. 4, 2149 (2013).
- Li, S., Haigh, K., Haigh, J. J., Vasudevan, A. Endothelial VEGF sculpts cortical cytoarchitecture. The Journal of Neuroscience. 33 (37), 14809-14815 (2013).
- Li, S., et al. Endothelial cell-derived GABA signaling modulates neuronal migration and postnatal behavior. Cell Research. 28 (2), 221-248 (2018).
- Lewis, D. A., Levitt, P. Schizophrenia as a disorder of neurodevelopment. Annual Review of Neuroscience. 25, 409-432 (2002).
- Lewis, D. A., Hashimoto, T., Volk, D. W. Cortical inhibitory neurons and schizophrenia. Nature Reviews Neuroscience. 6 (4), 312-324 (2005).
- Marin, O. Interneuron dysfunction in psychiatric disorders. Nature Reviews Neuroscience. 13 (2), 107-120 (2012).
- Levitt, P., Eagleson, K. L., Powell, E. M. Regulation of neocortical interneuron development and the implications for neurodevelopmental disorders. Trends in Neurosciences. 27 (7), 400-406 (2004).
- Treiman, D. M. GABAergic mechanisms in epilepsy. Epilepsia. 42 (3), 8-12 (2001).
- Datta, D., Subburaju, S., Kaye, S., Vasudevan, A. Human forebrain endothelial cells for cell-based therapy of neuropsychiatric disorders. Proceedings of 22nd Biennial Meeting of the International Society for Developmental Neuroscience. , (2018).
- Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient?. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 13 (11), 713-726 (2012).
- Ardhanareeswaran, K., Mariani, J., Coppola, G., Abyzov, A., Vaccarino, F. M. Human induced pluripotent stem cells for modelling neurodevelopmental disorders. Nature Reviews Neurology. 13 (5), 265-278 (2017).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cerebral Cortex. 19 (1), 32-41 (2009).
- Vissapragada, R., et al. Bidirectional crosstalk between periventricular endothelial cells and neural progenitor cells promotes the formation of a neurovascular unit. Brain Research. 1565, 8-17 (2014).
- JoVE Science Education Database. Cell Biology. The Transwell Migration Assay. Journal of Visualized Experiments. , (2019).
- Renaud, J., Martinovic, M. G. Development of an insert co-culture system of two cellular types in the absence of cell-cell contact. Journal of Visualized Experiments. 113, e54356 (2016).
- Guan, J. L. In vitro scratch assay: a convenient and inexpensive method for analysis of cell migration in vitro. Nature Protocols. 2 (2), 329-333 (2007).
- Nelson, R. D., Quie, P. G., Simmons, R. L. Chemotaxis under agarose: a new and simple method for measuring chemotaxis and spontaneous migration of human polymorphonuclear leukocytes and monocytes. The Journal of Immunology. 115 (6), 1650-1656 (1975).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. Journal of Cell Biology. 75 (2), 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G., Jones, G. Analyzing chemotaxis using the Dunn direct-viewing chamber. Methods in Molecular Biology. 75, 449-457 (1997).
- Kim, B. J., Wu, M. Microfluidics for mammalian cell chemotaxis. Annals of Biomedical Engineering. 40 (6), 1316-1327 (2012).
