Generatie van in-frame Gendeletie mutanten in Pseudomonas aeruginosa en testen op virulentie demping in een eenvoudig muis model van infectie
Summary
Hier beschrijven we een eenvoudig en reproduceerbaar Protocol van muismodel van infectie om de verzwakking van de genetisch gemodificeerde stammen van Pseudomonas aeruginosa te evalueren in vergelijking met de Amerikaanse Food and Drug ADMINISTRATION (FDA)-goedgekeurde Escherichia coli voor commerciële toepassingen.
Abstract
Micro-organismen zijn genetisch veelzijdig en divers en zijn uitgegroeid tot een belangrijke bron van vele commerciële producten en Biopharmaceuticals. Hoewel sommige van deze producten natuurlijk worden geproduceerd door de organismen, vereisen andere producten genetische manipulatie van het organisme om de productie opbrengsten te verhogen. Avirulente stammen van Escherichia coli zijn van oudsher de voorkeur bacteriesoorten voor de productie van Biopharmaceuticals; echter, sommige producten zijn moeilijk voor E. coli te produceren. Zo kunnen Avirulente stammen van andere bacteriesoorten nuttige alternatieven bieden voor de productie van sommige commerciële producten. Pseudomonas aeruginosa is een veel voorkomende en goed bestudeerde gram-negatieve bacterie die een geschikt alternatief voor E. colizou kunnen bieden. Echter, P. aeruginosa is een opportunistisch humaan pathogeen. Hier, we gedetailleerd een procedure die kan worden gebruikt voor het genereren van niet-pathogene stammen van P. aeruginosa door sequentiële genomische verwijderingen met behulp van de PEX100T-noti plasmide. Het belangrijkste voordeel van deze methode is om een marker-vrije stam te produceren. Deze methode kan worden gebruikt voor het genereren van sterk verzwakte P. aeruginosa stammen voor de productie van commerciële producten, of voor het ontwerpen van stammen voor andere specifieke toepassingen. We beschrijven ook een eenvoudig en reproduceerbaar muismodel van bacteriële systemische infectie via intraperitoneale injectie van gevalideerde test stammen om de verzwakking van de genetisch gemanipuleerde stam te testen in vergelijking met de door de FDA goedgekeurde BL21 stam van E. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa is een opportunistisch bacteriële pathogeen dat levensbedreigende ziekten bij de mens kan veroorzaken, vooral in de immuungecompromitteerde. De pathogeniteit van P. aeruginosa is te wijten aan de expressie van vele virulentie factoren, waaronder proteasen en lipopolysaccharide, evenals het vermogen om een beschermende biofilm1te vormen. Vanwege zijn vermogen om virulentie factoren te produceren en ziekte bij de mens veroorzaken, het gebruik van P. aeruginosa om commerciële producten te maken geeft veiligheidsproblemen. Niet-pathogene stammen van E. coli zijn van oudsher gebruikt om bio-ingenieur medische en commerciële producten voor menselijk gebruik. Echter, sommige producten zijn moeilijk voor E. coli te maken, en velen zijn verpakt in inclusie organen, waardoor extractie bewerkelijk. Ontwikkelde bacteriële stammen met de mogelijkheid om te maken en afscheiden van specifieke producten is zeer wenselijk, als afscheiding zou waarschijnlijk verhogen opbrengst en vergemakkelijken zuiveringsprocessen. Zo kunnen niet-pathogene stammen van andere soorten bacteriën (bijv. soorten die meer secretie trajecten gebruiken) nuttige alternatieven bieden voor e. coli. Onlangs rapporteerden we de ontwikkeling van een stam van P. aeruginosa, PGN5, waarbij de pathogeniteit en de toxiciteit van het organisme sterk verzwakte2. Belangrijk is dat deze stam nog steeds grote hoeveelheden van de polysaccharide alginaat produceert, een commercieel interessant onderdeel van de P. aeruginosa biofilm.
De PGN5 stam werd gegenereerd met behulp van een twee-stappen allel uitwisseling procedure met de pEX100T-noti plasmide om opeenvolgend verwijderen van vijf genen (Toxa, Plch, phzm, wapr, aroA) bekend om bij te dragen aan de pathogeniteit van het organisme. pEX100T-noti werd gegenereerd door de smai te veranderen in een noti restrictie enzym herkennings locatie binnen de meervoudige kloon site van de plasmide pEX100T, die werd ontwikkeld in het laboratorium van Herbert Schweizer3,4. De herkennings locatie voor het beperkings enzym NotI is een zeldzamer DNA-sequentie vergeleken met SmaI en is minder waarschijnlijk aanwezig in sequenties die gekloond worden, dus het is handiger voor kloon doeleinden. Het plasmide draagt genen die het mogelijk maken om te selecteren, met inbegrip van het bla -gen, dat ß-lactamase codeert en resistentie verleent aan carbenicillin, en het b. subtilissacB -gen, dat de gevoeligheid voor sucrose toekent (Figuur 1A). Het plasmide heeft ook een oorsprong van replicatie (ori) compatibel met E. coli, en een oorsprong van overdracht (orit) die het mogelijk maakt voor plasmide overdracht van E. coli naar Pseudomonas soorten via conjugatie. Echter, het plasmide mist een oorsprong van replicatie verenigbaar met Pseudomonas, en dus kan niet repliceren binnen Pseudomonas soorten (dat wil zeggen, het is een Pseudomonas Suicide vector). Deze kenmerken maken pEX100T-NotI ideaal voor het targeten van genetische verwijderingen van het Pseudomonas -chromosoom. Plasmide klonen stappen worden uitgevoerd met behulp van E. coli en de resulterende plasmide wordt overgebracht naar Pseudomonas door transformatie of conjugatie. Vervolgens wordt, via homologeuze recombinatie gebeurtenissen en selectieve stappen, de beoogde verwijdering in het frame gegenereerd, vrij van markeringen. Deze methode voor het sequentieel verwijderen van genomische gebieden uit het chromosoom van P. aeruginosa kan worden gebruikt voor het genereren van sterk verzwakte Pseudomonas stammen, zoals PGN5, of voor het ontwerpen van stammen voor andere specifieke toepassingen (bijv. stammen tekort aan enzym voor plasmide vermeerdering of stammen tekort aan proteasen voor de productie van eiwitten van belang).
De algehele virulentie van bacteriestammen wordt beïnvloed door groeiomstandigheden en-fasen, waarbij mutaties vaak voorkomen. Daarom kan het meten van de veiligheid van genetisch gemanipuleerde stammen een uitdaging zijn. Om bacteriële isolaten te evalueren voor systemische virulentie, hebben we een eerder gepubliceerd Protocol van infectie aangepast door intraperitoneale injectie van C57BL/6 muizen5. We hebben deze procedure gewijzigd om bevroren bacteriële voorraden voor injectie te gebruiken, wat een precieze dosering en eenvoudige validering van de gebruikte stammen toestaat. In dit model, de E. coli stam BL21, die is goedgekeurd door de FDA voor de productie van Biopharmaceuticals, werd gebruikt als een controle veiligheidsstandaard voor het bepalen van de relatieve pathogenese van de stam6,7,8. Het belangrijkste voordeel van het gebruik van deze methode is dat het reproduceerbaar is en minimaliseert bronnen van variatie, als infecterende stammen worden gevalideerd voor bacteriële cel nummer, fenotype, en genetische markers zowel voor als na infectie. Met deze gecontroleerde stappen wordt het aantal benodigde dieren verlaagd. In dit model, P. aeruginosa stammen die resulteren in C57BL/6 Murine sterftecijfers gelijk aan of minder dan E. coli BL21 wanneer geïnjecteerd intraperitoneaal kan worden beschouwd als verzwakte. Dit eenvoudige muismodel van infectie kan ook worden gebruikt om de verzwakte pathogeniteit van genetisch gemanipuleerde stammen van andere soorten te beoordelen met behulp van de door de FDA goedgekeurde E. coli -stam als referentie. Stappen 1-7 detail het genereren van sequentiële genomische verwijderingen in p. aeruginosa (Figuur 1) en stappen 8-12 detail het gebruik van een muismodel om de pathogeniteit van p. aeruginosa stammen te testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
De pEX100T-Not1 plasmide is een efficiënte bemiddelaar van sequentiële genomische deleties die marker-vrij en in-frame zijn. Bij het ontwerpen van bacteriële stammen voor verzwakte virulentie, vermindert het verwijderen van volledige genen sequenties in plaats van het genereren van puntmutaties de kans op reversie naar een virulente fenotype. Bovendien verzwakt elke genetische verwijdering van pathogeniteit de pathogenen verder, wat de stabiliteit van de verzwakking versterkt.
Deze methode …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gesteund door de National Institutes of Health (NIH) subsidies R44GM113545 en P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
Riferimenti
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
