Qui, descriviamo un protocollo semplice e riproducibile del modello murino di infezione per valutare l'attenuazione dei ceppi geneticamente modificati di Pseudomonas aeruginosa rispetto alla Escherichia coli approvata dalla FDA (Food and Drug Administration) degli Stati Uniti per applicazioni commerciali.
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Articolo metodologico
Generazione di mutanti di eliminazione genica in-frame in Pseudomonas aeruginosa e test per l'attenuazione della virulenza in un semplice modello di infezione del mouse
In questo articolo
Sommario
Abstract
I microrganismi sono geneticamente versatili e diversificati e sono diventati una fonte importante di molti prodotti commerciali e biofarmaceutici. Anche se alcuni di questi prodotti sono prodotti naturalmente dagli organismi, altri prodotti richiedono l'ingegneria genetica dell'organismo per aumentare le rese di produzione. I ceppi avirulenti di Escherichia coli sono stati tradizionalmente le specie batteriche preferite per la produzione di prodotti biofarmaceutici; tuttavia, alcuni prodotti sono difficili da produrre per E. coli. Pertanto, ceppi avirulenti di altre specie batteriche potrebbero fornire alternative utili per la produzione di alcuni prodotti commerciali. Pseudomonas aeruginosa è un batterio Gram-negativo comune e ben studiato che potrebbe fornire un'alternativa adatta a E. coli. Tuttavia, P. aeruginosa è un patogeno umano opportunistico. Qui, dettagliamo una procedura che può essere utilizzata per generare ceppi non patogeni di P. aeruginosa attraverso eliminazioni genomiche sequenziali utilizzando il plasmide pEX100T-NotI. Il vantaggio principale di questo metodo è quello di produrre una deformazione senza marcatori. Questo metodo può essere utilizzato per generare ceppi P. aeruginosa altamente attenuati per la produzione di prodotti commerciali, o per progettare ceppi per altri usi specifici. Descriviamo anche un modello murino semplice e riproducibile di infezione sistemica batterica tramite iniezione intraperitoneale di ceppi di prova convalidati per testare l'attenuazione del ceppo geneticamente ingegnerizzato rispetto al ceppo BL21 approvato dalla FDA di E. coli.
Introduzione
Pseudomonas aeruginosa è un patogeno batterico opportunistico che può causare malattie potenzialmente letali nell'uomo, specialmente nell'immunocompromesso. La patogenicità di P. aeruginosa è dovuta all'espressione di molti fattori di virulenza, tra cui proteasi e lipopolisaccharide, così come la sua capacità di formare un biofilm protettivo1. A causa della sua capacità di produrre fattori di virulenza e causare malattie negli esseri umani, utilizzando P. aeruginosa per fare prodotti commerciali presenta problemi di sicurezza. I ceppi non patogeni di E. coli sono stati tradizionalmente utilizzati per bioingeg....
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Protocollo
Prima di iniziare gli esperimenti sugli animali, il protocollo da utilizzare deve essere approvato dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC). L'approvazione per il protocollo descritto è stata ottenuta attraverso l'IACUC presso la Marshall University (Huntington, WV, USA).
1. Progettazione Plasmid
- Per generare una delezione genetica utilizzando il plasmide pEX100T-NotI, clonare le regioni di DNA che fiancheggiano la sequenza di delezione desiderata e inserirle nel sito di restrizione NotI del plasmide. L'inserto plasmide deve contenere circa 500 nucleotidi a monte della sequenza di destinazione direttame....
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Risultati
Come mostrato nella Figura 2, la cancellazione genomica mirata può essere confermata utilizzando colonia PCR con primer specifici che amplificano la regione di interesse. Le colonie che portano una delezione genomica produrranno una dimensione più breve della banda PCR rispetto alle colonie di tipo selvaggio. Uno schermo PCR di 10-12 colonie è di solito sufficiente per rilevare almeno una colonia che porta la delezione mirata. Se dopo più turni di schermate n.......
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Discussione
Il plasmide pEX100T-Not1 è un efficiente mediatore di eliminazioni genomiche sequenziali prive di marcatori e in-frame. Quando si ingegnerizzano ceppi batterici per la virulenza attenuata, la delezione di intere sequenze geniche piuttosto che la generazione di mutazioni puntiformi riduce la probabilità di ritorno a un fenotipo virulento. Inoltre, ogni delezione genica patogenicity attenua ulteriormente l'agente patogeno, rafforzando la stabilità dell'attenuazione.
Questo metodo può essere util.......
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Dichiarazioni
L'autore Hongwei D. Yu è Chief Science Officer e co-fondatore di Progenesis Technologies, LLC.
Ringraziamenti
Questo lavoro è stato sostenuto dai National Institutes of Health (NIH) sovvenzioni R44GM113545 e P20GM103434.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Provette da 0,2 mL con tappi piatti | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| Siringa da 1 mL | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| Cuvetta monouso in polistirene da 1,5 mL Fisher | Scientific 14955127 | ||
| Provette per microcentrifuga da 1,5 mL | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Fiale criogeniche da 2,0 mL | Corning | 430659 | tramite Fisher Scientific |
| Ago 27G | BD | 14-821-13B | tramite Fisher Scientific |
| Provette da 50 mL | Fisher Scientific | 05-539-13 | tramite Fisher Scientific |
| Accu block Bagno a secco digitale | Labnet | NC0205808 | tramite Fisher Scientific |
| Centrifuga da banco 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | tramite Fisher Scientific |
| Microcentrifuga da banco | Sorvall | 75-003-287 | tramite Fisher Scientific |
| Incubatore | per armadio VWR | 1540 | |
| Carbenicillina sale disodico | Fisher Scientific | ||
| , polistirene | Fisher Scientific | 14-956-6D | tramite Fisher Scientific |
| Anelli di inoculazione monouso | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Kit microbico Dneasy UltraClean (50) | Qiagen | 12224-50 | o metodo/fornitore preferito |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | o metodo/fornitore preferito |
| EcoRI-HF, endonucleasi di restrizione | New England BioLabs | R3101L | |
| Cuvette per elettroporazione | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Kit di |
| legatura del DNA Scientific FastLink II | Epicentre Technologies | LK6201H | tramite Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glicerolo | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Mastermix incolore | Promega | M7833 | tramite Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Salute animale | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Serie III Sistema di imaging in vivo | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamicina monosolfato | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarosio | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Brodo | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Elettroporatore | BioRad | 1652100 | |
| agar nobile, ultrapuro | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, endonucleasi di restrizione | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Polvere | salina tamponata con fosfatoSigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolamento agar | Difco | 292710 | tramite Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolamento brodo | Alpha Biosciences | P16-115 | Lotto su misura |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | o metodo/fornitore preferito |
| Incubatore a scuotimento | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | a 200 giri/min |
| SimpliAmp Termociclatore | Applied Biosystems | A24811 | |
| Latte scremato | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific Piccole |
| piastre (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spettrofotometro | Bio-Rad | 170-2525 | o metodo/fornitore |
| preferito Saccarosio | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Stuzzicadenti, rotondo | Diamante | marca di stuzzicadenti, autoclavato | |
| TOPO TA Kit di clonazione, per la sequenza. | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Perkins | and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Pinza per sistema di anestesia a gas | Scienze della vita/Xenogeno |
Riferimenti
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuate....
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Ristampe e permessi
