감염의 간단한 마우스 모델에서 녹농균 및 독성 감쇠에 대한 테스트에서 프레임 내 유전자 삭제 돌연변이의 생성
Summary
여기서, 우리는 미국 식품의약국(FDA)에서 승인된 대장균에 비해 녹농균의 유전자 변형 균주의 감쇠를 평가하기 위해 마우스 모델의 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 상업적 응용을 위해 설명한다.
Abstract
미생물은 유전적으로 다재다능하고 다양하며 많은 상용 제품 및 바이오 의약품의 주요 공급원이 되었습니다. 이러한 제품 중 일부는 자연적으로 유기체에 의해 생산되지만, 다른 제품은 생산의 수율을 높이기 위해 유기체의 유전 공학을 필요로한다. 대장균의 Avirulent 균주는 전통적으로 바이오 의약품을 생산하기위한 바람직한 세균 종이었다; 그러나 일부 제품은 대장균을 생산하기가 어렵습니다. 따라서, 다른 세균성 종의 avirulent 긴장은 몇몇 상업적인 제품의 생산을 위한 유용한 대안을 제공할 수 있었습니다. 슈도모나스 녹농균은 대장균에적합한 대안을 제공할 수 있는 일반적이고 잘 연구된 그람 음성 박테리아입니다. 그러나, P. aeruginosa는 기회 인간 병원체입니다. 여기서, 우리는 pEX100T-NotI 플라스미드를 이용한 순차적 게놈 삭제를 통해 P. aeruginosa의 비병원성 균주를 생성하는데 사용될 수 있는 절차를 상세히 설명한다. 이 방법의 주요 장점은 마커없는 변형을 생성하는 것입니다. 이 방법은 상용 제품의 생산을 위한 고도로 감쇠된 P. aeruginosa 균주를 생성하거나, 또는 다른 특정 용도를 위한 균주를 설계하기 위하여 이용될 수 있다. 우리는 또한 대장균의 FDA 승인 BL21 긴장에 비해 유전자 조작 균주의 감쇠를 테스트하기 위해 검증 된 테스트 균주의 복강 내 주입을 통해 세균 성 전신 감염의 간단하고 재현 가능한 마우스 모델을 설명합니다.
Introduction
슈도모나스 녹농균은 인간, 특히 면역 손상에서 생명을 위협하는 질병을 일으킬 수있는 기회 세균성 병원체입니다. P. aeruginosa의 병원성은 프로테아제 및 리포폴리사카라이드를 포함한 많은 독성 인자의 발현뿐만 아니라 보호생물막을형성하는 능력에 기인한다 1. 때문에 독성 요인을 생성하고 인간에서 질병을 일으킬 수있는 능력, 상용 제품을 만들기 위해 P. aeruginosa를 사용하여 안전 문제를 제시. 대장균의 비병원성 균주는 전통적으로 인간의 사용을 위해 의료 및 상업용 제품을 생체 공학하는 데 사용되어 왔습니다. 그러나 일부 제품은 대장균을 만들기가 어렵고, 많은 제품이 포함 기관에 포장되어 추출이 힘들다. 특정 제품을 만들고 분비할 수 있는 능력을 가진 엔지니어링된 세균성 균주는 수율을 증가시키고 정화 과정을 용이하게 하기 때문에 매우 바람직합니다. 따라서, 다른 종의 박테리아(예를 들어, 더 많은 분비 경로를 이용하는 종)의 비병원성 균주는 대장균에유용한 대안을 제공할 수 있다. 우리는 최근에 유기체의 병원성 및 독성이 고도로 감쇠되는 P. aeruginosa,PGN5의 균주의 발달을 보고했다2. 중요한 것은, 이 균주는 여전히 다당류 알긴산, P. aeruginosa 생물막의 상업적으로 흥미로운 성분을 대량생산한다.
PGN5 균주는 5개의유전자(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA)를순차적으로 삭제하기 위해 pEX100T-NotI 플라스미드와 2단계 알레릭 교환 절차를 사용하여 생성되었으며, 이는 유기체의 병원성에 기여하는 것으로 알려져 있다. pEX100T-NotI는 허버트 슈바이저의 실험실3,4에서개발된 플라스미드 pEX100T의 다중 복제 부위 내에서 Ti 제한 효소 인식 부위로 SmaI를 변경하여 생성되었다. 제한 효소 NotI에 대한 인식 부위는 SmaI에 비해 드문 DNA 서열이며 복제되는 서열에 존재할 가능성이 적고, 따라서 복제 목적으로 더 편리하다. 플라스미드는 카르베니실린에 대한 저항성을 부여하는 ß-lactamase를 인코딩하고 카르베니실린에 대한 저항성을 부여하는 블라 유전자와 자당에 대한 민감성을 부여하는 B. subtilissacB 유전자를 포함하여 선택을 허용하는 유전자를 운반합니다(그림 1A). 플라스미드는 또한 대장균과호환되는복제(ori)의기원을 가지고 있으며, 대장균에서 슈도모나스 종으로 플라스미드 이송을 허용하는 이송(oriT)의 기원을 컨쥬게이션을 통해 전달한다. 그러나, 플라스미드는 슈도모나스와호환되는 복제의 기원이 결여되어 있으며, 따라서 슈도모나스 종 내에서 복제할 수 없다(즉, 슈도모나스 자살 벡터). 이러한 특성은 pEX100T-NotI를 슈도모나스 염색체로부터의 유전자 삭제를 표적으로 하는 데 이상적입니다. 플라스미드 클로닝 단계는 대장균을 사용하여 수행되고 결과 플라스미드는 변형 또는 컨쥬게이션에 의해 슈도모나스로 이송된다. 그런 다음, 상동 재조합 이벤트 및 선택적 단계를 통해, 표적 인프레임 삭제가 생성되고, 마커가 없는. P. aeruginosa의 염색체에서 게놈 지구를 순차적으로 삭제하는 이 방법은 PGN5같이 고도로 감쇠된 슈도모나스 균주를 생성하거나, 다른 특정 용도를 위한 균주를 설계하는 데 사용될 수 있습니다(예를 들어, 단백질의 플라스미드 전파 또는 균주 결핍에 대한 종부 결핍균에 대한 균주 결핍).
박테리아의 긴장의 전반적인 독성은 돌연변이가 빈번히 생기는 동안 성장 조건 및 단계에 의해 영향을 받습니다. 따라서 유전자 조작 균주의 안전도를 측정하는 것은 어려울 수 있습니다. 전신 독성에 대한 세균 분리를 평가하기 위해, 우리는 C57BL/6 마우스5의복강 내 주사에 의한 감염의 이전에 발표된 프로토콜을 적용하였다. 우리는 주입을 위해 냉동 세균성 주식을 사용하기 위하여 이 절차를 수정했습니다, 사용된 긴장의 정확한 주입 그리고 쉬운 검증을 허용했습니다. 이 모델에서, 바이오 의약품의 생산을 위해 FDA 승인을받은 대장균 균주 BL21은, 균주6,7,8의상대적인 병인을 결정하기 위한 제어 안전성 표준으로 사용되었다. 이 방법을 사용하는 주요 장점은 감염 균주가 감염 전후 의 세균 세포 수, 표현형 및 유전 마커에 대해 검증되기 때문에 재현 가능하고 변이의 근원을 최소화한다는 것입니다. 이러한 제어 단계를 통해 필요한 동물의 수가 줄어듭니다. 이 모델에서, C57BL/6 murine 사망률을 초래하는 P. aeruginosa 균주는 복강 내 주입시 대장균 BL21보다 동일하거나 더 적은 것으로 간주될 수 있다. 감염의 이 간단한 마우스 모형은 또한 참조로 FDA 승인된 대장균 긴장을 사용하여 그밖 종에게서 유전으로 조작된 긴장의 감쇠된 병원성을 평가하기 위하여 이용될 수 있습니다. 단계 1-7은 P. aeruginosa에서 순차적 게놈 결실의 생성을 상세히(도 1)및 단계 8-12 단계는 P. aeruginosa 균주의 병원성을 시험하기 위하여 마우스 모형의 사용을 상세히.
Protocol
Representative Results
Discussion
pEX100T-Not1 플라스미드는 마커가 없고 프레임 내에 있는 순차적 게놈 제거의 효율적인 중재자입니다. 감쇠된 독성을 위한 세균성 긴장을 기술할 때, 점 돌연변이를 생성하는 보다는 오히려 전체 유전자 순서의 삭제는 악성 표현형으로 복귀의 가능성을 감소시다. 추가적으로, 각 병원성 유전자 삭제는 감쇠의 안정성을 강화, 병원체를 더 감쇠합니다.
이 방법은 또한 플라스미드 …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (NIH) 보조금 R44GM1113545 및 P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
Riferimenti
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