Geração de mutantes de deleção de genes no quadro em Pseudomonas aeruginosa e testes para atenuação de virulência em um modelo simples de infecção por camundongos
Summary
Aqui, descrevemos um protocolo simples e reproduzível do modelo de infecção do rato para avaliar a atenuação das cepas geneticamente modificadas de Pseudomonas aeruginosa em comparação com os Estados Unidos Food and Drug Administration (FDA) aprovado Escherichia coli para aplicações comerciais.
Abstract
Os microrganismos são geneticamente versáteis e diversificados e tornaram-se uma importante fonte de muitos produtos comerciais e biofármacos. Embora alguns desses produtos sejam produzidos naturalmente pelos organismos, outros produtos exigem engenharia genética do organismo para aumentar os rendimentos da produção. Cepas virulentas de Escherichia coli têm sido tradicionalmente as espécies bacterianas preferidas para a produção de biofármacos; no entanto, alguns produtos são difíceis para E. coli para produzir. Assim, cepas virulentas de outras espécies bacterianas poderiam fornecer alternativas úteis para a produção de alguns produtos comerciais. Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa comum e bem estudada que poderia fornecer uma alternativa adequada para E. coli. No entanto, P. aeruginosa é um patógeno humano oportunista. Aqui, detalhamos um procedimento que pode ser usado para gerar cepas não patogênicas de P. aeruginosa através de exclusões genômicas sequenciais usando o plasmídeo pEX100T-NotI. A principal vantagem deste método é produzir uma cepa livre de marcadores. Este método pode ser usado para gerar cepas p. aeruginosa altamente atenuadas para a produção de produtos comerciais, ou para projetar cepas para outros usos específicos. Também descrevemos um modelo de camundongo simples e reprodutível de infecção sistêmica bacteriana por meio de injeção intraperitoneal de cepas de teste validadas para testar a atenuação da cepa geneticamente modificada em comparação com a cepa BL21 aprovada pela FDA de E. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa é um patógeno bacteriano oportunista que pode causar doenças fatais em seres humanos, especialmente no imunocomprometido. A patogenicidade de P. aeruginosa é devido à expressão de muitos fatores de virulência, incluindo proteases e lipopolissacarídeos, bem como a sua capacidade de formar um biofilme protetor1. Devido à sua capacidade de produzir fatores de virulência e causar doenças em seres humanos, usando P. aeruginosa para fazer produtos comerciais apresenta preocupações de segurança. Cepas não patogênicas de E. coli têm sido tradicionalmente usadas para bioengenharia de produtos médicos e comerciais para uso humano. No entanto, alguns produtos são difíceis para E. coli fazer, e muitos são embalados em corpos de inclusão, tornando a extração trabalhosa. Cepas bacterianas projetadas com a capacidade de fazer e secretar produtos específicos é altamente desejável, como secreção provavelmente aumentaria o rendimento e facilitar os processos de purificação. Assim, cepas não patogênicas de outras espécies de bactérias (por exemplo, espécies que utilizam mais vias de secreção) podem fornecer alternativas úteis para E. coli. Recentemente relatou o desenvolvimento de uma cepa de P. aeruginosa, PGN5, em que a patogenicidade e toxicidade do organismo é altamente atenuada2. Importante, esta cepa ainda produz grandes quantidades do alginato polissacarídeo, um componente comercialmente interessante do biofilme P. aeruginosa.
A cepa PGN5 foi gerada usando um procedimento de troca alocílica de duas etapas com o plasmid pEX100T-NotI para excluir sequencialmente cinco genes(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA), conhecido por contribuir para a patogenicidade do organismo. pEX100T-NotI foi gerado mudando o SmaI para um local de reconhecimento de enzimas de restrição NotI dentro do local de clonagem múltipla do plasmídeo pEX100T, que foi desenvolvido no laboratório3,4de Herbert Schweizer. O local de reconhecimento para a enzima de restrição NotI é uma sequência de DNA mais rara em comparação com smai e menos propensos a estar presente em seqüências sendo clonadas, portanto, é mais conveniente para fins de clonagem. O plasmídeo carrega genes que permitem a seleção, incluindo o gene bla, que codifica ß-lactamase e confere resistência à carbenicilina, e o gene B. subtilissacB, que confere sensibilidade à sacarose (Figura 1A). O plasmídeo também carrega uma origem de replicação (ori) compatível com E. coli, e uma origem de transferência(oriT)que permite a transferência plasmídea de E. coli para espécies pseudomonas via conjugação. No entanto, o plasmídeo carece de uma origem de replicação compatível com Pseudomonas,e, portanto, não pode replicar dentro da espécie Pseudomonas (ou seja, é um vetor de suicídio Pseudomonas). Estas características fazem pEX100T-NotI ideal para alvejar deleções genéticas do cromossoma de Pseudomonas. As etapas de clonagem de Plasmid são realizadas usando E. coli e o plasmídeo resultante é transferido para Pseudomonas por transformação ou conjugação. Então, através de eventos de recombinação homóloga e etapas seletivas, a exclusão direcionada no quadro é gerada, sem marcadores. Este método de apagar sequencialmente regiões genômicas do cromossomo de P. aeruginosa poderia ser usado para gerar cepas pseudomonas altamente atenuadas, como PGN5, ou para projetar cepas para outros usos específicos (por exemplo, cepas deficientes em endonucleases para propagação plasminável ou cepas deficientes em proteases para a produção de proteínas de interesse).
A virulência geral de cepas de bactérias é afetada por condições e fases de crescimento, durante as quais as mutações ocorrem com freqüência. Portanto, medir a segurança das cepas geneticamente modificadas pode ser um desafio. Para avaliar isolados bacterianos para a virulência sistêmica, adaptamos um protocolo de infecção previamente publicado por injeção intraperitoneal de camundongos C57BL/65. Nós modificamos este procedimento para usar estoques bacterianos congelados para a injeção, que permitiu a dosagem precisa e a validação fácil das tensões usadas. Neste modelo, a cepa E. coli BL21, aprovada pela FDA para produção de biofármacos, foi utilizada como padrão de segurança de controle para determinar a patogênese relativa da cepa6,7,8. A principal vantagem para o uso deste método é que ele é reproduzível e minimiza as fontes de variação, pois as cepas infectantes são validadas para o número de células bacterianas, fenótipo e marcadores genéticos antes e depois da infecção. Com estas etapas controladas, o número de animais necessários é reduzido. Neste modelo, cepas de P. aeruginosa que resultam em taxas de mortalidade de urina C57BL/6 iguais ou inferiores a E. coli BL21 quando injetadas intraperitoneally podem ser consideradas atenuadas. Este modelo simples do rato da infecção pode igualmente ser usado para avaliar o pathogenicity atenuado de tensões genetically projetadas de outras espécies usando a tensão FDA-aprovada do E. coli como a referência. Os passos 1-7 detalham a geração de exclusões genômicas sequenciais em P. aeruginosa (Figura 1) e passos 8-12 detalham o uso de um modelo de mouse para testar a patogenicidade das cepas p. aeruginosa.
Protocol
Representative Results
Discussion
O plasmídeo pEX100T-Not1 é um mediador eficiente de exclusões genômicas sequenciais que são livres de marcadores e no quadro. Quando a engenharia de cepas bacterianas para a vidulência atenuada, a exclusão de sequências genéticas inteiras em vez de gerar mutações pontuais diminui a probabilidade de reversão a um fenótipo virulento. Além disso, cada aupressão gênica de patogenicidade atenua ainda mais o patógeno, reforçando ainda mais a estabilidade da atenuação.
Este métod…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) concede R44GM113545 e P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
Riferimenti
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