Generering av in-Frame gen radering mutanter i Pseudomonas aeruginosa och testning för virulens dämpning i en enkel musmodell av infektion
Summary
Här beskriver vi ett enkelt och reproducerbart protokoll av musmodell av infektion för att utvärdera försvagningen av den genetiskt modifierade stammar av Pseudomonas aeruginosa i jämförelse med USA Food and Drug Administration (FDA)-godkända Escherichia coli för kommersiella tillämpningar.
Abstract
Mikroorganismer är genetiskt mångsidig och varierande och har blivit en viktig källa till många kommersiella produkter och Biopharmaceuticals. Även om vissa av dessa produkter produceras naturligt av organismer, andra produkter kräver genteknik av organismen att öka avkastningen av produktionen. Avirulent stammar av Escherichia coli har traditionellt varit den föredragna Bakteriearten för att framställa biologiska läkemedel; emellertid, vissa produkter är svåra för E. coli att producera. Således kan Avirulenta stammar av andra bakteriearter ge användbara alternativ för produktion av vissa kommersiella produkter. Pseudomonas aeruginosa är en vanlig och väl studerat gramnegativ bakterie som kan ge ett lämpligt alternativ till E. coli. Emellertid, P. aeruginosa är en opportunistisk mänsklig patogen. Här, vi detalj en procedur som kan användas för att generera nonpatogena stammar av P. aeruginosa genom sekventiella genomiska borttagningar med hjälp av pEX100T- Den största fördelen med denna metod är att producera en markör-fri stam. Denna metod kan användas för att generera mycket försvagade P. aeruginosa -stammar för produktion av kommersiella produkter, eller för att konstruera stammar för andra specifika användningar. Vi beskriver också en enkel och reproducerbar musmodell av bakteriell systemisk infektion via intraperitoneal injektion av validerade test stammar för att testa försvagningen av den genetiskt modifierade stammen i jämförelse med FDA-godkända BL21 stam av E. coli.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa är en opportunistisk bakteriell patogen som kan orsaka livshotande sjukdomar hos människor, särskilt i den immunsupprimerade. Patogenicitet av P. aeruginosa beror på uttrycket av många virulensfaktorer, inklusive proteaser och lipopolysackarid, samt dess förmåga att bilda en skyddande biofilm1. På grund av dess förmåga att producera virulensfaktorer och orsaka sjukdom hos människor, med hjälp av P. aeruginosa att göra kommersiella produkter presenterar säkerhetsproblem. Icke-patogena stammar av E. coli har traditionellt använts för att bioengineer medicinska och kommersiella produkter för humant bruk. Emellertid, vissa produkter är svåra för E. coli att göra, och många är förpackade i inkludering organ, vilket gör utvinning mödosam. Konstruerade bakteriestammar med förmågan att göra och utsöndra specifika produkter är mycket önskvärt, som sekretion skulle sannolikt öka avkastningen och lindra reningsprocesser. Sålunda, icke-patogena stammar av andra arter av bakterier (t. ex. arter som utnyttjar mer sekretion vägar) kan ge användbara alternativ till e. coli. Vi rapporterade nyligen utvecklingen av en stam av P. aeruginosa, PGN5, där patogenitet och toxicitet av organismen är mycket försvagade2. Viktigare, denna stam producerar fortfarande stora mängder av polysackarid alginate, en kommersiellt intressant del av P. aeruginosa biofilm.
Den PGN5 stammen genererades med hjälp av en två-stegs alleliska utbyte förfarande med pEX100T-e plasmid att sekventiellt ta bort fem gener (toxa, plch, phzm, wapr, Aroa) kända för att bidra till patogeniteten av organismen. pEX100T-är en produkt som genereras genom att ändra Smai till en för att erkänna en sida av enzymet erkännande av multipel kloning av plasmid pEX100T, som utvecklades i Herbert schweizers labb3,4. Erkännande platsen för restriktionsenzymen är en ovanligare DNA-sekvens jämfört med SmaI och mindre sannolikt att vara närvarande i sekvenser som klonas, vilket gör det bekvämare för kloning. Plasmiden bär gener som möjliggör val, inklusive bla genen, som kodar ß-Lactamase och ger resistens mot carbenicillin, och B. subtilissacB genen, som ger känslighet för sackaros (figur 1A). Plasmid bär också ett ursprung av replikering (Ori) kompatibel med E. coli, och ett ursprung av överföring (Orit) som möjliggör plasmid överföring från E. coli till Pseudomonas arter via konjugering. Emellertid, plasmiden saknar ett ursprung av replikering förenligt med Pseudomonas, och därmed inte kan replikera inom Pseudomonas arter (dvs., det är en Pseudomonas självmord vektor). Dessa egenskaper gör pEX100T-en idealisk för att rikta genetiska borttagningar från Pseudomonas -kromosomen. Plasmid kloning steg utförs med hjälp av E. coli och den resulterande plasmid överförs till Pseudomonas genom omvandling eller konjugering. Sedan, genom homolog rekombination händelser och selektiva steg, den riktade in-Frame radering genereras, markör-fri. Denna metod för sekventiellt ta bort genomiska regioner från kromosomen av P. aeruginosa kan användas för att generera mycket försvagade Pseudomonas stammar, som PGN5, eller att utforma stammar för andra specifika användningsområden (t. ex., stammar bristfällig i endonukleaser för plasmid förökning eller stammar brist på proteaser för produktion av proteiner av intresse).
Den totala virulens stammar av bakterier påverkas av tillväxtförhållanden och faser, under vilka mutationer förekommer ofta. Därför kan det vara utmanande att mäta säkerheten hos genetiskt modifierade stammar. För att utvärdera bakteriella isolat för systemisk virulens, anpassade vi ett tidigare publicerat protokoll för infektion genom intraperitoneal injektion av C57BL/6 möss5. Vi modifierade detta förfarande för att använda frysta bakteriella lager för injektion, som tillät exakt dosering och enkel validering av de stammar som används. I denna modell, E. coli stam BL21, som har FDA-godkänt för produktion av Biopharmaceuticals, användes som en kontroll säkerhetsstandard för att bestämma den relativa patogenesen av stammen6,7,8. Den största fördelen med att använda denna metod är att det är reproducerbara och minimerar källor till variation, som infekterande stammar valideras för bakteriell cell nummer, fenotyp, och genetiska markörer både före och efter infektion. Med dessa kontrollerade steg minskar antalet djur som krävs. I denna modell, P. aeruginosa stammar som resulterar i C57BL/6 murin dödlighet priser lika med eller mindre än E. coli BL21 när injiceras intraperitonealt kan anses vara försvagade. Denna enkla musmodell av infektion kan också användas för att bedöma den försvagade patogenicitet av genetiskt modifierade stammar från andra arter med hjälp av FDA-godkända E. coli stam som referens. Steg 1-7 detalj generering av sekventiella genomiska borttagningar i p. aeruginosa (figur 1) och steg 8-12 detalj användning av en musmodell för att testa patogenicitet av p. aeruginosa stammar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den pEX100T-Not1 plasmid är en effektiv medlare av sekventiella genomiska borttagningar som är markör-fri och i-Frame. När tekniska bakteriestammar för försvagad virulens, borttagande av hela gensekvenser snarare än att generera punktmutationer minskar sannolikheten för återgång till en virulent fenotyp. Dessutom dämpar varje patogenicitet gen borttagning patogenen ytterligare, vilket förstärker stabiliteten i försvagningen.
Denna metod kan också användas för att generera geno…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health (NIH) bidrag R44GM113545 och P20GM103434.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
Riferimenti
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
