Pseudomonas aeruginosa In-Frame Gen Silme Mutantlar Üretimi ve Enfeksiyon Basit Bir Fare Modelinde Virülans Zayıflama sıiçin Test
Summary
Burada, abd gıda ve ilaç İdaresi (FDA) onaylı Escherichia coli ticari uygulamalar için karşılaştırıldığında Pseudomonas aeruginosa genetik olarak değiştirilmiş suşlarının zayıflamasını değerlendirmek için enfeksiyon fare modelibasit ve tekrarlanabilir bir protokol açıklar.
Abstract
Mikroorganizmalar genetik olarak çok yönlü ve çeşitlidir ve birçok ticari ürün ve biyofarmasötik kaynağı haline gelmiştir. Bu ürünlerin bazıları doğal olarak organizmalar tarafından üretilse de, diğer ürünler üretim verimini artırmak için organizmanın genetik mühendisliğine ihtiyaç duyarlar. Escherichia coli Avirulent suşları geleneksel biyofarmasötik üretmek için tercih edilen bakteri türleri olmuştur; ancak, bazı ürünlerin E. coli için üretmesi zordur. Böylece, diğer bakteri türlerinin avirulent suşları bazı ticari ürünlerin üretimi için yararlı alternatifler sağlayabilir. Pseudomonas aeruginosa, E. coli’yeuygun bir alternatif sunabilecek yaygın ve iyi çalışılmış bir Gram-negatif bakteridir. Ancak, P. aeruginosa fırsatçı bir insan patojenidir. Burada, pEX100T-NotI plazmid kullanarak sıralı genomik deletiyonlar yoluyla P. aeruginosa nonpatojenik suşları oluşturmak için kullanılabilecek bir prosedür ayrıntılı. Bu yöntemin en büyük avantajı işaretsiz bir gerinim üretmektir. Bu yöntem, ticari ürünlerin üretimi için yüksek zayıflatılmış P. aeruginosa suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir. Biz de E. coliFDA onaylı BL21 suşu ile karşılaştırıldığında genetiği değiştirilmiş suşu zayıflatma test etmek için doğrulanmış test suşlarının intraperitoneal enjeksiyon yoluyla bakteriyel sistemik enfeksiyonun basit ve tekrarlanabilir fare modeli açıklar.
Introduction
Pseudomonas aeruginosa insanlarda hayatı tehdit eden hastalıklara neden olabilir fırsatçı bir bakteriyel patojen, özellikle immunocompromised. P. aeruginosa patojenite proteazlar ve lipopolisakkarit de dahil olmak üzere birçok virülans faktörlerin ifade kaynaklanmaktadır, yanı sıra koruyucu bir biyofilm oluşturmak için yeteneği1. Virülans faktörleri üretme ve insanlarda hastalığa neden olma becerisi nedeniyle, P. aeruginosa’yı ticari ürünler yapmak için kullanmak güvenlik kaygılarını da ortaya çıkarmaktadır. E. coli nonpatojenik suşları geleneksel olarak insan kullanımı için tıbbi ve ticari ürünlerin biyomühendisliğinde kullanılmaktadır. Ancak, bazı ürünler E. coli yapmak zordur, ve birçok ekleme organları paketlenmiş, çıkarma zahmetli hale. Salgıverim büyük olasılıkla verimi artırmak ve arıtma süreçlerini kolaylaştırmak gibi, belirli ürünler yapmak ve salgılamak yeteneği ile tasarlanmış bakteriyel suşları, son derece arzu edilir. Böylece, diğer bakteri türlerinin patojenik olmayan suşları (örneğin, daha fazla salgı yolları kullanan türler) E. coli’yeyararlı alternatifler sağlayabilir. Biz son zamanlarda P. aeruginosabir suşu gelişimi rapor , PGN5, hangi organizmanın patojenitesi ve toksisitesi yüksek zayıflatılmış2. Daha da önemlisi, bu tür hala polisakkarit aljinat büyük miktarlarda üretir, P. aeruginosa biyofilm ticari olarak ilginç bir bileşeni.
PGN5 suşu, organizmanın patojenitesine katkıda bulunduğu bilinen beş geni(toxA, plcH, phzM, wapR, aroA)sırayla silmek için pEX100T-NotI plazmid ile iki aşamalı bir allelik değişim prosedürü kullanılarak oluşturuldu. pEX100T-NotI Plazmid pEX100T, Herbert Schweizer’s labgeliştirilenbirden fazla klonlama sitesi içinde bir NotI restriksiyon enzim tanıma sitesi SmaI değiştirerek oluşturuldu3 ,4. Restriksiyon enzimi NotI için tanıma sitesi SmaI ile karşılaştırıldığında daha nadir bir DNA dizisidir ve klonlanan dizilerde bulunma olasılığı daha düşüktür, bu nedenle klonlama amacıyla daha uygundur. Plazmid, ß-laktamaz kodlayan ve karbenisin direncini ortaya koyan bla geni ve sakaroza duyarlılık sağlayan B. subtilissacB geni de dahil olmak üzere seçime olanak sağlayan genleri taşır (Şekil 1A). Plazmid aynı zamanda E. coliile uyumlu çoğaltma(ori)ve konjugasyon yoluyla E. coli’den Pseudomonas türlerine plazmid transferine izin veren transferin(oriT)kökenini de taşır. Ancak, plazmid Pseudomonasile uyumlu çoğaltma bir kökeni yoksun , ve böylece Pseudomonas türleri içinde çoğaltmak olamaz (yani, bir Pseudomonas intihar vektörü). Bu özellikler pEX100T-NotI’yi Pseudomonas kromozomundaki genetik silmeleri hedeflemek için ideal kılmıştır. Plazmid klonlama adımları E. coli kullanılarak gerçekleştirilir ve ortaya çıkan plazmid dönüşüm veya konjugasyon ile Pseudomonas aktarılır. Daha sonra, homolog rekombinasyon olayları ve seçici adımlar sayesinde, hedeflenen çerçeve içi silme, işaretleyicisiz oluşturulur. P. aeruginosa kromozomundan genomik bölgeleri sırayla silebilmek için bu yöntem PGN5 gibi yüksek oranda zayıflatılmış Pseudomonas suşları oluşturmak veya diğer özel kullanımlar için suşları tasarlamak için kullanılabilir (örn. plazmid yayılımı için enforükleazlarda eksik suşlar veya ilgi proteinlerinin üretimi için protelazlarda eksik suşlar).
Bakteri suşlarının genel virülansı büyüme koşulları ve evrelerinden etkilenir ve bu süre zarfında mutasyonlar sık görülür. Bu nedenle, genetiği değiştirilmiş suşların güvenliğini ölçmek zor olabilir. Sistemik virülans için bakteriyel izole değerlendirmek için, C57BL/6 fareler5intraperitoneal enjeksiyon u tarafından daha önce yayınlanmış bir enfeksiyon protokolü uyarlanmış. Bu prosedürü, kullanılan suşların hassas dosupve kolay doğrulanmasına olanak sağlayan enjeksiyon için dondurulmuş bakteri stokları kullanmak üzere modifiye ettik. Bu modelde, Biyofarmasötik üretimi için FDA onaylı olan E. coli suşu BL21, suş göreceli patogenezi belirlemek için bir kontrol güvenlik standardı olarak kullanılmıştır6,7,8. Bu yöntemi kullanmanın en büyük avantajı, enfeksiyon öncesi ve sonrası bakteri hücre numarası, fenotip ve genetik belirteçler için doğrulanmış olan bulaşma suşları, tekrarlanabilir olması ve varyasyon kaynaklarını en aza indirmesidir. Bu kontrollü adımlarla gerekli hayvan sayısı azalır. Bu modelde, enjekte edilen intraperitoneally e. coli BL21’e eşit veya daha az C57BL/6 murine mortalite oranlarına neden olan P. aeruginosa suşları zayıflatılmış kabul edilebilir. Bu basit fare enfeksiyonu modeli, referans olarak FDA onaylı E. coli suşunu kullanarak diğer türlerden genetik olarak tasarlanmış suşların zayıflatılmış patojenliğini değerlendirmek için de kullanılabilir. 1-7. adımlar P. aeruginosa (Şekil 1)ve 8-12 adımlarında sıralı genomik silmelerin oluşumunu ayrıntılı olarak inceleyin.
Protocol
Representative Results
Discussion
pEX100T-Not1 plazmid, marker içermeyen ve çerçeve içi ardışık genomik silmelerin etkili bir aracısi. Bakteri suşları zayıflatılmış virülans için mühendislik zaman, nokta mutasyonları üreten yerine tüm gen dizilerinin silinmesi öldürücü bir fenotip reversiyon olasılığını azaltır. Ayrıca, her patojengen delemesi patojeni daha da zayıflatarak zayıflama nın stabilitesini güçlendirir.
Bu yöntem aynı zamanda sadece plazmid kesici uç tasarımıdeğiştirerek, no…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) tarafından desteklenmiştir R44GM113545 ve P20GM103434 hibe.
Materials
| 0.2 mL tubes with flat caps | ThermoScientific | AB-0620 | via Fisher Scientific |
| 1 mL Syringe | BD | 22-253-260 | via Fisher Scientific |
| 1.5 mL disposable polystyrene cuvette | Fisher Scientific | 14955127 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 27G needle | BD | 14-821-13B | via Fisher Scientific |
| 50 mL tubes | Fisher Scientific | 05-539-13 | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Centrifuge 5804R | Eppendorf | 04-987-372 | via Fisher Scientific |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Carbenicillin disodium salt | Fisher Scientific | BP2648250 | |
| Culture Test Tube, Polystyrene | Fisher Scientific | 14-956-6D | via Fisher Scientific |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| Dneasy UltraClean Microbial Kit (50) | Qiagen | 12224-50 | or preferred method/vendor |
| E.Z.N.A. Cycle Pure Kit (50) | Omega bio-tek | D6493-01 | or preferred method/vendor |
| EcoRI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3101L | |
| Electroporation Cuvettes | Bulldog Bio | NC0492929 | via Fisher Scientific |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| GoTaq G2 Colorless Master Mix | Promega | M7833 | via Fisher Scientific |
| Isothesia Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 29405 | |
| IVIS Lumina XRMS Series III In Vivo Imaging System | Perkins and Elmer | CLS136340 | |
| Kanamycin monosulfate | Fisher Scientific | BP906-5 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| MicroPulser Electroporator | BioRad | 1652100 | |
| Noble agar, ultrapure | Affymetris/USB | AAJ10907A1 | via Fisher Scientific |
| NotI-HF, restriction endonuclease | New England BioLabs | R3189 | |
| One Shot TOP10 Electrocomp E. coli | Invitrogen | C404052 | via Fisher Scientific |
| Phosphate buffered saline powder | Sigma | P3813-10PAK | Sigma-Aldrich |
| Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation broth | Alpha Biosciences | P16-115 | Custom made batch |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems | A24811 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Sucrose | Fisher Scientific | S5-500 | |
| Toothpicks, round | Diamond | Any brand of toothpicks, autoclaved | |
| TOPO TA Cloning Kit, for seqeuncing | Invitrogen | 45-0030 | |
| XAF-8 Anesthesia System Filters | Perkins and Elmer | 118999 | |
| XGI 8 Gas Anesthesia System | Caliper Life Sciences/Xenogen |
Riferimenti
- Gellatly, S. L., Hancock, R. E. Pseudomonas aeruginosa: new insights into pathogenesis and host defenses. Pathogens and Disease. 67 (3), 159-173 (2013).
- Valentine, M. E., et al. Generation of a highly attenuated strain of Pseudomonas aeruginosa for commercial production of alginate. Microbial Biotechnology. , (2019).
- Schweizer, H. P., Hoang, T. T. An improved system for gene replacement and xylE fusion analysis in Pseudomonas aeruginosa. Gene. 158 (1), 15-22 (1995).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. Journal of Bacteriology. 191 (7), 2285-2295 (2009).
- Yu, H., Boucher, J. C., Hibler, N. S., Deretic, V. Virulence properties of Pseudomonas aeruginosa lacking the extreme-stress sigma factor AlgU (sigmaE). Infection and Immunity. 64 (7), 2774-2781 (1996).
- Baeshen, M. N., et al. Production of Biopharmaceuticals in E. coli: Current Scenario and Future Perspectives. Journal of Microbiology and Biotechnology. 25 (7), 953-962 (2015).
- Marisch, K., Bayer, K., Cserjan-Puschmann, M., Luchner, M., Striedner, G. Evaluation of three industrial Escherichia coli strains in fed-batch cultivations during high-level SOD protein production. Microbial Cell Factories. 12, 58 (2013).
- Ferrer-Miralles, N., Domingo-Espin, J., Corchero, J. L., Vazquez, E., Villaverde, A. Microbial factories for recombinant pharmaceuticals. Microbial Cell Factories. 8, 17 (2009).
- Horton, R. M., Cai, Z. L., Ho, S. N., Pease, L. R. Gene splicing by overlap extension: tailor-made genes using the polymerase chain reaction. Biotechniques. 8 (5), 528-535 (1990).
- Horton, R. M., Hunt, H. D., Ho, S. N., Pullen, J. K., Pease, L. R. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes: gene splicing by overlap extension. Gene. 77 (1), 61-68 (1989).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1989).
- Figurski, D. H., Helinski, D. R. Replication of an origin-containing derivative of plasmid RK2 dependent on a plasmid function provided in trans. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (4), 1648-1652 (1979).
- Choi, K. H., Schweizer, H. P. mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa. Nature Protocols. 1 (1), 153-161 (2006).
- Choi, K. H., Kumar, A., Schweizer, H. P. A 10-min method for preparation of highly electrocompetent Pseudomonas aeruginosa cells: application for DNA fragment transfer between chromosomes and plasmid transformation. Journal of Microbiological Methods. 64 (3), 391-397 (2006).
- Liang, R., Liu, J. Scarless and sequential gene modification in Pseudomonas using PCR product flanked by short homology regions. BMC Microbiology. 10, 209 (2010).
- Martinez-Garcia, E., de Lorenzo, V. Engineering multiple genomic deletions in Gram-negative bacteria: analysis of the multi-resistant antibiotic profile of Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology. 13 (10), 2702-2716 (2011).
- Song, C. W., Lee, S. Y. Rapid one-step inactivation of single or multiple genes in Escherichia coli. Biotechnology Journal. 8 (7), 776-784 (2013).
- Yan, M. Y., et al. CRISPR-Cas12a-Assisted Recombineering in Bacteria. Applied and Environmental Microbiology. 83 (17), (2017).
- Prakash, O., Nimonkar, Y., Shouche, Y. S. Practice and prospects of microbial preservation. FEMS Microbiology Letters. 339 (1), 1-9 (2013).
