اعداد سطح القوقعة في فاره الكبار
Summary
تقدم هذه المقالة طريقه تعديل سطح القوقعة التي تتطلب الكلس واستخدام لاصقه الخلية والانسجه للالتزام قطع من ظهاره قوقعة الراس إلى 10 مم زلة غطاء الجولة لمناعي في قوقعة الماوس الكبار.
Abstract
المعالجة السمعية في القوقعة تعتمد علي سلامه خلايا الشعر الميكانيكية. علي مدي العمر ، يمكن الحصول علي فقدان السمع من مسببات عديده مثل التعرض للضوضاء المفرطة ، واستخدام الادويه السامة للاذن ، والتهابات الاذن البكتيرية أو الفيروسية ، وإصابات الراس ، وعمليه الشيخوخة. فقدان خلايا الشعر الحسية هو سمه مرضيه شائعه من أنواع فقدان السمع المكتسبة. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تتلف المشبك الداخلي لخلايا الشعر بالإهانات الخفيفة. لذلك ، تعد الاستعدادات السطحية لظهاره قوقعة الاذن ، بالاشتراك مع تقنيات المناعة والتصوير البؤري ، أداه مفيده جدا للتحقيق في امراض القوقعة ، بما في ذلك فقدان المشابك الشريطية وخلايا الشعر الحسية ، التغيرات في مستويات البروتين في خلايا الشعر والخلايا الداعمة ، وتجديد خلايا الشعر ، وتحديد التعبير الجيني للتقرير (اي GFP) للتحقق من التوصيل الناجح وتحديد أنواع الخلايا المحولة. والقوقعة ، وهي بنيه عظميه حلزونية الشكل في الاذن الداخلية ، تحمل جهاز النهاية الحسية السمعية ، وهو جهاز كورتي (OC). يتم تضمين خلايا الشعر الحسية والخلايا الداعمة المحيطة بها في قناه القوقعة والباقي علي الغشاء القاعدي ، والتي يتم تنظيمها بطريقه اللوزتين مع الكشف عن الترددات العالية التي تحدث في القاعدة والتردد المنخفض في القمه. مع توافر المعلومات الجزيئية والوراثية والقدرة علي التلاعب بالجينات بواسطة الضربة القاضية وتقنيات الطرق ، وقد استخدمت الفئران علي نطاق واسع في البحوث البيولوجية ، بما في ذلك في السمع العلم. ومع ذلك ، فان قوقعة الماوس البالغة ضئيله ، ويتم تغليف ظهاره القوقعة في متاهة عظميه ، مما يجعل التشريح المجهري صعبا. علي الرغم من انه تم تطوير تقنيات التشريح واستخدامها في العديد من المختبرات ، فان طريقه التشريح المجهري المعدلة باستخدام لاصق الخلايا والانسجه أسهل وأكثر ملاءمة. ويمكن استخدامه في جميع أنواع قوقعة الماوس الكبار بعد الكلس.
Introduction
وتكرس القوقعة للكشف عن الصوت والمسؤولة عن السمع. يتم لف القناة القوقعة في شكل حلزوني في المتاهة العظمية ويحمل الجهاز السمعي الحسي النهاية ، وجهاز كورتي (OC). يعتمد OC علي غشاء بأزيار ، مما يشكل ظهاره قوقعة ، مع طول حوالي 5.7 ملم عندما غير ملفوف في الفئران CBA/caj الكبار1،2. ونظرا لان درجه التردد العالي التي يتم تنظيمها بالترددات المرتفعة المكتشفة في القاعدة والترددات المنخفضة في القمه ، فان ظهاره القوقعة غالبا ما تنقسم إلى ثلاثه أجزاء للمقارنة التحليلية: المنعطفات المتوسطة والقاعدية المقابلة لمنخفضه ، المتوسطة ، والكشف عن الترددات العالية ، علي التوالي. بالاضافه إلى مجموعه من الخلايا الداعمة ، تتكون OC من صف واحد من خلايا الشعر الداخلية (IHCs) الموجودة في الوسيط وثلاثه صفوف من خلايا الشعر الخارجية (OHCs) الموجودة بشكل أفقي فيما يتعلق بدوامه القوقعة.
المعالجة السمعية الصحيحة تعتمد علي سلامه خلايا الشعر الحسية في القوقعة. تلف أو فقدان خلايا الشعر الحسية هو سمه مرضيه شائعه لفقدان السمع المكتسبة ، الناجمة عن العديد من المسببات مثل التعرض للضوضاء المفرطة ، واستخدام الادويه السامة للاذن ، والتهابات الاذن البكتيرية أو الفيروسية ، وإصابات الراس ، والشيخوخة عمليه3. بالاضافه إلى ذلك ، يمكن ان تضعف سلامه ووظيفة الخلية الداخلية للشعر/العصب السمعي العصبية بالإهانات الخفيفة4. مع توافر المعلومات الجزيئية والوراثية والتلاعب في الجينات بالضربة القاضية وتقنيات الطرق ، وقد استخدمت الفئران علي نطاق واسع في السمع العلم. علي الرغم من ان قوقعة الماوس الكبار هي ضئيله وتحيط ظهاره القوقعة بكبسوله عظميه مما يؤدي إلى الأجزاء المجهرية الصعبة من الناحية الفنية ، والاستعدادات السطحية لظهاره في تركيبه مع المناعة أو مناعي وقد استخدمت الصور المحورية علي نطاق واسع للتحقيق في امراض القوقعة ، بما في ذلك فقدان الشريط العصبي وخلايا الشعر ، والتغيرات في مستويات البروتينات في خلايا الشعر الحسية وخلايا الدعم ، وتجديد خلايا الشعر. كما تم استخدام مستحضرات سطح القوقعة لتحديد نمط التعبير عن جينات المراسلين (اي GFP) وتاكيد التوصيل الناجح وتحديد أنواع الخلايا المحولة. وقداستخدمت هذه التقنيات في السابق لدراسة أليات الجزيئية الكامنة وراء فقدان السمع الناجم عن الضوضاء باستخدام الفئران CBA/J الكبار5,6,7,8,9.
خلافا لمناعي باستخدام أقسام البارافين أو الحلوى للحصول علي أجزاء صغيره مقطعه عبر القوقعة التي تحتوي علي ثلاثه خلايا الشعر الخارجي (OHCs) وخليه واحده الشعر الداخلي (IHC) علي كل قسم ، والاستعدادات سطح القوقعة تسمح التصور من طول OC للعد خلايا الشعر الحسية والمشابك الشريط والمناعة من خلايا الشعر الحسية المقابلة للترددات وظيفية محدده. ويبين الجدول 1 رسم الترددات السمعية كداله للمسافة علي طول دوامه القوقعة في الماوس البالغ CBA/J وفقا للدراسات التي أجريت من مولر1 وفيبرغ وكانلون1،2. وقد استخدمت علي نطاق واسع الاستعدادات سطح قوقعة للتحقيق في امراض القوقعة4،5،6،7،8،9،10 ،11،12،13،14،15. تم وصف الطريقة الكاملة لتشريح القوقعة في كتاب حرره هانز انجستروم في 196616. وتم صقل هذه التقنية فيما بعد وتكييفها مع مجموعه متنوعة من الأنواع علي النحو الموصوف في الأدبيات التي كتبها عدد من العلماء في العلوم السمعية10و11و12و13و 15,17 وبواسطة مختبرات ايتون-peabody في ماساتشوستس العين والاذن18. وفي الاونه الاخيره ، أبلغت شركه مونتغمري وآخرون19عن طريقه أخرى لتشريح القوقعة. يعد التشريح المجهري لقوقعة الزرع خطوه أساسيه وحاسمه لتحضيرات سطح القوقعة. ومع ذلك ، فان تشريح قوقعة الماوس يمثل تحديا فنيا ويتطلب ممارسه كبيره. هنا ، يتم تقديم طريقه معدله لتحضير سطح القوقعة للاستخدام في قوقعة الماوس البالغة. هذا الأسلوب يتطلب الكلس واستخدام لاصقه الخلية والانسجه (اي ، خليه تاك) للتقيد قطع ظهاره قوقعة الراس إلى 10 ملم الشفتين المستديرة للمناعة. وقد استخدمت علي نطاق واسع الخلية والانسجه لاصقه لمناعي20. هذه الطريقة المعدلة لتشريح القوقعة المجهرية بسيطه نسبيا مقارنه بتلك التي تم الإبلاغ عنها سابقا18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر التشريح المجهري لقوقعة الاذن من المستحضرات السطحية كامله التركيب بالاشتراك مع المناعة المناعية أداه أساسيه لتحقيق الامراض الداخلية للاذن واليات الجزيئية. هذه الطريقة المعدلة لتشريح قوقعة الفاره باستخدام الخلية ولاصق الانسجه يبسط هذا الاجراء الصعب.
علي الرغم من ان ه…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وكان المشروع البحثي الموصوف مدعوما بمنحه R01 DC009222 من المعهد الوطني لامراض الصمم وغيرها من اضطرابات الاتصالات ، والمعاهد الوطنية للصحة. وقد اجري هذا العمل في مبني WR في MUSC في المساحة التي تم تجديدها بدعم من منحه C06 RR014516. تم إسكان الماشية في مرافق الحيوانية MUSC CRI بدعم من منحه C06 RR015455 من برنامج مرافق البحوث خارج الأورال للمركز الوطني للموارد البحثية. ويشكر المؤلفون الدكتور جوتشين شاخت علي تعليقاته القيمة وعلي اندرا تالاسكا لتصحيح المخطوطات.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Riferimenti
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
- Sha, S. H., Schacht, J. Emerging therapeutic interventions against noise-induced hearing loss. Expert Opinion on Investigational Drugs. 26 (1), 85-96 (2017).
- Kujawa, S. G., Liberman, M. C. Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after “temporary” noise-induced hearing loss. Journal of Neuroscience. 29 (45), 14077-14085 (2009).
- Chen, F. Q., Zheng, H. W., Hill, K., Sha, S. H. Traumatic Noise Activates Rho-Family GTPases through Transient Cellular Energy Depletion. Journal of Neuroscience. 32 (36), 12421-12430 (2012).
- Hill, K., Yuan, H., Wang, X., Sha, S. H. Noise-Induced Loss of Hair Cells and Cochlear Synaptopathy Are Mediated by the Activation of AMPK. Journal of Neuroscience. 36 (28), 7497-7510 (2016).
- Xiong, H. Inhibition of Histone Methyltransferase G9a Attenuates Noise-Induced Cochlear Synaptopathy and Hearing Loss. Journal of Association for Research in Otolaryngology. 20 (3), 217-232 (2019).
- Yuan, H., et al. Autophagy attenuates noise-induced hearing loss by reducing oxidative stress. Antioxidant & Redox Signaling. 22 (15), 1308-1324 (2015).
- Wang, X. Mitochondrial Calcium Transporters Mediate Sensitivity to Noise-Induced Losses of Hair Cells and Cochlear Synapses. Frontiers in Molecular Neuroscience. 11, 469 (2018).
- Bohne, B. A., Harding, G. W. Processing and analyzing the mouse temporal bone to identify gross, cellular and subcellular pathology. Hearing Research. 109 (1-2), 34-45 (1997).
- Jiang, H., Sha, S. H., Forge, A., Schacht, J. Caspase-independent pathways of hair cell death induced by kanamycin in vivo. Cell Death & Differentiation. 13 (1), 20-30 (2006).
- Johnsson, L. G., Hawkins, J. E. Sensory and neural degeneration with aging, as seen in microdissections of the human inner ear. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology. 81 (2), 179-193 (1972).
- Wan, G., Gomez-Casati, M. E., Gigliello, A. R., Liberman, M. C., Corfas, G. Neurotrophin-3 regulates ribbon synapse density in the cochlea and induces synapse regeneration after acoustic trauma. Elife. 3, (2014).
- Wang, L. Targeting HDAC with a novel inhibitor effectively reverses paclitaxel resistance in non-small cell lung cancer via multiple mechanisms. Cell Death & Disease. 7, 2063 (2016).
- Weber, T., et al. Rapid cell-cycle reentry and cell death after acute inactivation of the retinoblastoma gene product in postnatal cochlear hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (2), 781-785 (2008).
- Engström, H., Ades, H. W., Andersson, A. . Structural pattern of the organ of Corti: a systematic mapping of sensory cells and neural elements. , (1966).
- Hawkins, J. E., Linthicum, F. H., Johnsson, L. G. Cochlear and vestibular lesions in capsular otosclerosis as seen in microdissection. Annals of Otology, Rhinology, and Laryngology Supplement. 87, 1-40 (1978).
- . MassEyeAndEar.org Available from: https://www.masseyeandear.org/research/otolaryngology/eaton-peabody-laboratories (2019)
- Montgomery, S. C., Cox, B. C. Whole Mount Dissection and Immunofluorescence of the Adult Mouse Cochlea. Journal of Visualized Experiments. (107), (2016).
- . Corning Cell Culture Surfaces Available from: https://www.corning.com/catalog/cls/documents/brochures/CLS-C-DL-006.pdf (2019)
- Nouvian, R., Beutner, D., Parsons, T. D., Moser, T. Structure and function of the hair cell ribbon synapse. The Journal of Membrane Biology. 209 (2-3), 153-165 (2006).
- Atturo, F., Barbara, M., Rask-Andersen, H. On the anatomy of the ‘hook’ region of the human cochlea and how it relates to cochlear implantation. Audiology and Neurootology. 19 (6), 378-385 (2014).
- Kim, N., Steele, C. R., Puria, S. The importance of the hook region of the cochlea for bone-conduction hearing. Biophysical Journal. 107 (1), 233-241 (2014).
- Zheng, H. W., Chen, J., Sha, S. H. Receptor-interacting protein kinases modulate noise-induced sensory hair cell death. Cell Death & Disease. 5, 1262 (2014).
- Brown, L. N., et al. Macrophage-Mediated Glial Cell Elimination in the Postnatal Mouse Cochlea. Frontiers in Molecular Neuroscience. 10, 407 (2017).
