Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto
Summary
Questo articolo presenta un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato che richiede la decalcificazione e l’uso di un adesivo per cellule e tessuti per aderire i pezzi di epitemi cocleari a 10 mm rotondi schede di copertura per l’immunostochimica nelle cocleee di topo adulto.
Abstract
L’elaborazione uditiva nella coclea dipende dall’integrità delle cellule ciliate meccanosensoriali. Nel corso della vita, la perdita dell’udito può essere acquisita da numerose eziologie come l’esposizione a rumori eccessivi, l’uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell’orecchio, lesioni alla testa, e il processo di invecchiamento. La perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune delle varietà di perdita dell’udito acquisita. Inoltre, la sinapsi delle cellule ciliate interne può essere danneggiata da lievi insulti. Pertanto, i preparati superficiali di epiteli cocleari, in combinazione con tecniche di immunoetichettatura e immagini confocali, sono uno strumento molto utile per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi del nastro e cellule ciliate sensoriali, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate e nelle cellule di supporto, rigenerazione delle cellule dei capelli e determinazione dell’espressione genica del rapporto (cioè GFP) per la verifica della trasduzione e l’identificazione dei tipi di cellule trasdotte. La coclea, una struttura a spirale osa nell’orecchio interno, contiene l’organo finale sensoriale uditivo, l’organo di Corti (OC). Le cellule ciliate sensoriali e le cellule portante circostanti nell’OC sono contenute nel condotto cocleare e poggiano sulla membrana basilare, organizzate in modo tonotopico con rilevamento ad alta frequenza che si verifica nella base e a bassa frequenza nell’apice. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la capacità di manipolare i geni mediante tecniche di knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca biologica, anche nella scienza dell’udito. Tuttavia, la coclea adulta del topo è minuscola, e l’epitelio cocleare è incapsulato in un labirinto osseo, rendendo difficile la microdissezione. Anche se le tecniche di dissezione sono state sviluppate e utilizzate in molti laboratori, questo metodo di microdissezione modificato utilizzando l’adesivo per cellule e tessuti è più facile e più conveniente. Può essere utilizzato in tutti i tipi di cocleari di topi adulti dopo la decalcificazione.
Introduction
La coclea è dedicata alla rilevazione del suono e responsabile dell’udito. Il condotto cocleare è arrotolato a spirale nel labirinto osseo e detiene l’organo finale sensoriale uditivo, l’organo di Corti (OC). L’OC poggia sulla membrana basilare, che costituisce l’epitelio cocleare, con una lunghezza di circa 5,7 mm quando srotolato nei topi adulti CBA/CaJ1,2. Poiché l’OC è tonotopicamente organizzato con alte frequenze rilevate nella base e nelle basse frequenze nell’apice, l’epitelio cocleare è spesso diviso in tre parti per confronti analitici: i giri apicali, medi e basali corrispondenti a bassi, medio e ad alta frequenza, rispettivamente. Oltre a una serie di cellule di supporto, l’OC è composto da una fila di cellule ciliate interne (IHC) situate medialmente e tre file di cellule ciliate esterne (OHC) situate lateralmente rispetto alla spirale cocleare.
Una corretta elaborazione uditiva dipende dall’integrità delle cellule ciliate sensoriali nella coclea. Il danno o la perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune della perdita dell’udito acquisita, causata da numerose eziologie come l’esposizione a rumori eccessivi, l’uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell’orecchio, lesioni alla testa e l’invecchiamento processo3. Inoltre, l’integrità e la funzione delle cellule ciliate interne / sinapsi nervose uditive possono essere compromesse da lievi insulti4. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la manipolazione dei geni mediante tecniche knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella scienza dell’udito. Anche se la coclea adulta del topo è minuscola e l’epitelio cocleare è circondato da una capsula ossea con conseguente microdissezioni tecnicamente difficili, le preparazioni superficiali dell’epitelio in combinazione con immunoetichettatura o immunohistochimica e le immagini confocali sono state ampiamente utilizzate per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi a nastro e cellule ciliate, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate sensoriali e nelle cellule di supporto, e rigenerazione delle cellule dei capelli. I preparati cocleari sono stati utilizzati anche per determinare il modello di espressione dei geni reporter (ad esempio, GFP) e confermare la trasduzione riuscita e identificare i tipi di cellule trasdotte. Queste tecniche sono state precedentemente utilizzate per lo studio di meccanismi molecolari alla base della perdita dell’udito indotta dal rumore utilizzando topi adulti CBA/J5,6,7,8,9.
A differenza dell’immunohistochimica che utilizza sezioni di paraffina o criosezioni per ottenere piccole porzioni trasversali della coclea che contengono tre cellule ciliate esterne (OHC) e una cellula pilifena interna (IHC) su ogni sezione, i preparati cocleari della superficie visualizzazione dell’intera lunghezza dell’OC per il conteggio delle cellule ciliate sensoriali e delle sinapsi a nastro e l’immunoetichettatura delle cellule ciliate sensoriali corrispondenti a specifiche frequenze funzionali. La tabella 1 mostra la mappatura delle frequenze uditive in funzione della distanza lungo la lunghezza della spirale cocleare nel topo CBA/J adulto secondo gli studi di Muller1 e Viberg e Canlon1,2. I preparati di superficie cocleare sono stati ampiamente utilizzati per lo studio delle patologie cocleari4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. L’intero metodo di dissezione cocleare è stato originariamente descritto in un libro edito da Hans Engstrom nel 196616. Questa tecnica è stata successivamente perfezionata e adattata a una varietà di specie, come descritto nella letteratura da un certo numero di scienziati nell’udito scientifico10,11,12,13, 15,17 e dagli Eaton-Peabody Laboratories presso Massachusetts Eye e Ear18. Recentemente, un altro metodo di dissezione cocleare è stato segnalato da Montgomery et al.19. La microdisezione della coclea è un passo essenziale e critico per le preparazioni della superficie cocleare. Tuttavia, la dissezione delle cocleari di topi è una sfida tecnica e richiede una pratica considerevole. Qui, viene presentato un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato per l’uso nelle cocleae dei topi adulti. Questo metodo richiede la decalcificazione e l’uso di adesivi cellulari e tissutali (ad esempio, Cell-Tak) per aderire ai pezzi di epitelio cocleare a 10 mm rotazioni rotonde per l’immunoetichettatura. L’adesivo per cellule e tessuti è stato ampiamente utilizzato per l’immunoistochimica20. Questo metodo di microdissezione cocleare modificato è relativamente semplice rispetto a quelli precedentemente riportati18,19.
Protocol
Representative Results
Discussion
La microdissezione cocleare dei preparati superficiali a montaggio intero in combinazione con l’immunoetichettatura fornisce uno strumento di base per lo studio delle patologie dell’orecchio interno e dei meccanismi molecolari. Questo metodo di dissezione cocleare del topo adulto modificato utilizzando l’adesivo della cellula e del tessuto semplifica questa difficile procedura.
Anche se questo metodo di preparazione della superficie cocleare modificato è relativamente facile e accessibile, ri…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il progetto di ricerca descritto è stato sostenuto dalla sovvenzione R01 DC009222 dell’Istituto Nazionale di Sordità e Altri Disturbi della Comunicazione, National Institutes of Health. Questo lavoro è stato condotto nel WR Building di MUSC in uno spazio ristrutturato supportato dalla sovvenzione C06 RR014516. Gli animali erano ospitati in strutture animali MUSC CRI supportate dalla sovvenzione C06 RR015455 dell’Extramural Research Facilities Program del National Center for Research Resources. Gli autori ringraziano il Dr. Jochen Schacht per i suoi preziosi commenti e Andra Talaska per la revisione del manoscritto.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Riferimenti
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