성인 마우스의 달팽이관 표면 준비
Summary
본 문서는 성인 마우스 달팽이관에서 면역 조직 화학을 위한 10 mm 둥근 커버 전표에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위하여 세포 및 조직 접착제의 decalcification 및 사용을 요구하는 변형된 달팽이관 표면 준비 방법을 제시합니다.
Abstract
달팽이관의 청각 처리는 메카노 감각 모발 세포의 무결성에 달려 있습니다. 일생 동안, 청력 손실은 과도한 소음에 노출, 이독성 약물의 사용, 세균 또는 바이러스 성 귀 감염, 머리 부상 및 노화 과정과 같은 수많은 병인에서 취득 될 수있다. 감각 모발 세포의 손실은 획득 한 청력 손실의 품종의 일반적인 병리학 적 특징입니다. 또한, 내부 모발 세포 시 냅 스 가벼운 모욕에 의해 손상 될 수 있습니다. 따라서, 달팽이관 상피의 표면 제제는, 면역 표지 기술 및 공초점 이미지와 함께, 리본 시냅스와 감각 모발 세포의 손실을 포함하여 달팽이관 병리의 조사에 매우 유용한 도구입니다, 모발 세포의 단백질 수준 변화 및 지원 세포, 모발 세포 재생 및 보고서 유전자 발현 (즉, GFP)의 결정은 성공적인 트랜스덕션의 검증 및 형질전환 세포 유형의 식별을 위한 것입니다. 달팽이관, 내이에 뼈 나선형 모양의 구조, 청각 감각 말단 기관, 코르티의 기관을 보유 (OC). OC에 있는 감각 머리 세포 및 주변 지지 세포는 달팽이관 덕트에 포함되고 바실라 막에 휴식, 정점에 있는 기지 및 저주파에서 일어나는 고주파 검출을 가진 tonotopic 방식으로 조직됩니다. 분자 및 유전 정보의 가용성과 녹아웃 및 노크 인 기술에 의해 유전자를 조작 할 수있는 능력으로, 마우스는 청각 과학을 포함한 생물학적 연구에 널리 사용되어왔다. 그러나, 성숙한 마우스 달팽이관은 아주 작기 이고, 달팽이관 상피는 뼈 미로에서 캡슐화되고, microdissection을 어렵게 만듭니다. 많은 실험실에서 해부 기술이 개발되고 사용되었지만, 세포 및 조직 접착제를 사용하는 이 변형된 미세 해부 방법은 더 쉽고 편리합니다. 그것은 decalcification 다음 성인 마우스 달팽이관의 모든 유형에 사용할 수 있습니다.
Introduction
달팽이관은 소리 감지에 전념하고 청력을 담당합니다. 달팽이관 덕트뼈 미로에 나선형 모양으로 코일 및 청각 감각 끝 기관, 코르티의 기관을 보유 (OC). OC는 달팽이관 막에 달려, 성인 CBA/CaJ 마우스에서 풀어 때 대략 5.7 mm의 길이를 가진 달팽이관 상피를구성합니다 1,2. OC는 정점의 베이스에서 검출된 고주파와 낮은 주파수로 비공식적으로 구성되기 때문에, 달팽이관 상피는 종종 분석 비교를 위해 세 부분으로 나뉩니다: 낮은 에 상응하는 정점, 중간 및 기저 회전, 각각 고주파 검출을 할 수 있습니다. 지지 세포의 배열 이외에, OC는 달팽이관 나선형에 대하여 측면으로 위치한 내측 및 외부 모발 세포 (OHCs)의 3 행에 위치한 내부 모발 세포 (IHCs)의 한 행으로 구성된다.
올바른 청각 처리는 달팽이관의 감각 모발 세포의 무결성에 달려 있습니다. 감각 모발 세포의 손상 또는 손실은 과도한 소음에 노출, 이독성 약물의 사용, 세균 또는 바이러스 성 귀 감염, 머리 부상 및 노화와 같은 수많은 병인으로 인한 후천성 청력 손실의 일반적인 병리학 적 특징입니다. 프로세스3. 또한, 내부 모발 세포 / 청각 신경 시냅스의 무결성과 기능은 가벼운 모욕에 의해 손상 될 수있다4. 분자 및 유전 정보의 가용성과 녹아웃 및 노크 인 기술에 의한 유전자 조작으로 마우스는 청력 과학에서 널리 사용되어 왔습니다. 성인 마우스 달팽이관은 소문자이고 달팽이관 상피는 기술적으로 어려운 미세 내부, 면역 표지 또는 면역 조직 화학과 조합하여 상피의 표면 제제의 결과로 뼈 캡슐에 둘러싸여 있지만 및 공초점 이미지는 광범위하게 달팽이관 병리의 조사를 위해 사용되었습니다, 리본 시냅스와 모발 세포의 손실을 포함, 감각 모발 세포와 지원 세포에서 단백질의 수준의 변화, 및 모발 세포 재생. 달팽이관 표면 제제는 또한 리포터 유전자(즉, GFP)의 발현 패턴을 결정하고 성공적인 트랜스덕션을 확인하고 형질전환 세포 유형을 식별하는 데 사용되어 왔다. 이러한 기술은 이전에 성인 CBA/J 마우스5,6,7,8,9를사용하여 소음 유발 난청을 기초로 하는 분자 메커니즘의 연구에 사용되어 왔다.
파라핀 절편이나 극저온절을 이용한 면역조직화학과는 달리 각 섹션에 3개의 외부 모발 세포(OHCs)와 1개의 내부 모발 세포(IHC)를 포함하는 달팽이관의 작은 단면 부분을 얻을 수 있으며, 달팽이관 표면 제제는 특정 기능적 주파수에 대응하는 감각 모발 세포 및 리본 시냅스와 면역 라벨링을 계수하기 위한 OC의 전체 길이를 시각화합니다. 표 1은 뮬러1과 비버그 및 캔론1,2의연구에 따른 성인 CBA/J 마우스에서 달팽이관 나선형의 길이를 따라 거리 의 함수로서 청각 주파수의 매핑을 나타낸다. 달팽이관 표면 제제는 달팽이관 병리의 조사를 위해 널리 이용되었습니다4,5,6,7,8,9,10 ,11,12,13,14,15. 전체 마운트 달팽이관 해부 방법은 원래 1966년 16에서 한스 엥스트롬에 의해 편집 된 책에 설명되었다. 이 기술은 이후 과학10,11,12,13,청각 과학의 다수의 과학자들에 의해 문헌에 기술된 바와 같이 다양한 종에 정제및 적응되었다. 15,17 및 매사추세츠 눈과 귀18에서이튼 – 피바디 연구소에 의해 . 최근, 또 다른 달팽이관 해부 방법은 몽고메리 외19에의해 보고되었다 . 달팽이관의 미세 해부는 달팽이관 표면 준비를 위한 필수적이고 중요한 단계입니다. 그러나 마우스 달팽이관 해부는 기술적인 과제이며 상당한 연습이 필요합니다. 여기서, 변형된 달팽이관 표면 제제 방법은 성인 마우스 달팽이관에서 사용하기 위해 제시된다. 이 방법은 면역 라벨링을 위해 10 mm 라운드 커버슬립에 달팽이관 상피의 조각을 부착하기 위해 세포 및 조직 접착제 (즉, Cell-Tak)의 decalcification 및 사용을 요구합니다. 세포 및 조직 접착제는면역조직화학(20)에널리 사용되고 있다. 이러한 수정된 달팽이관 미세해부 방법은 이전에 보고된18,19에비해 비교적 간단하다.
Protocol
Representative Results
Discussion
면역 라벨링과 함께 전체 마운트 표면 제제의 달팽이관 미세 해부는 내이 병리 및 분자 메커니즘을 조사하는 기본 도구를 제공합니다. 이러한 변형된 성체 마우스 달팽이관 해부 방법은 세포 및 조직 접착제를 사용하여 이러한 어려운 절차를 단순화한다.
이 수정된 달팽이관 표면 준비 방법은 비교적 쉽고 접근하기 쉽지만 숙련도를 달성하기 위해서는 여전히 연습이 필요합?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
설명된 연구 프로젝트는 청각 장애 및 기타 통신 장애에 대한 국립 연구소, 건강의 국립 연구소에서 보조금 R01 DC009222에 의해 지원되었다. 이 작업은 보조금 C06 RR014516에 의해 지원 되는 개조 된 공간에서 MUSC의 WR 건물에서 수행되었다. 동물은 국립 연구 자원 센터의 교외 연구 시설 프로그램에서 보조금 C06 RR015455에 의해 지원 MUSC CRI 동물 시설에 보관되었다. 저자는 그의 귀중한 의견에 대한 박사 요헨 샤흐트 감사와 원고의 교정 안드라 탈라스카.
Materials
| 10-mm Rund Coverslips | Microscopy products for science and industry | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-mouse IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-mouse IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-rabbit IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Carboard Micro Slide Trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Corning Petri Dishes | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Forceps | FST fine science tools | 11251-20 | |
| EDTA Disodium Salt | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel with Tris Buffer | Electron Microscopy Sciences | 17985-10 | |
| Four-well Cell Culture Dishes | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Goat Anti-myosin VIIa Antibody | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Microscope Slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Mouse Anti-CtBP2 Antibody | BD Biosciences | #612044 | |
| Mouse Anti-Glu2R Antibody | Millipore | MAB397 | |
| Normal Goat Serum | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Scalpel | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools | 15001-08 |
Riferimenti
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