Questo articolo presenta un metodo di preparazione della superficie cocleare modificato che richiede la decalcificazione e l'uso di un adesivo per cellule e tessuti per aderire i pezzi di epitemi cocleari a 10 mm rotondi schede di copertura per l'immunostochimica nelle cocleee di topo adulto.
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Articolo metodologico
Preparazione della superficie cocleare nel topo adulto
In questo articolo
Sommario
Abstract
L'elaborazione uditiva nella coclea dipende dall'integrità delle cellule ciliate meccanosensoriali. Nel corso della vita, la perdita dell'udito può essere acquisita da numerose eziologie come l'esposizione a rumori eccessivi, l'uso di farmaci ototossici, infezioni batteriche o virali dell'orecchio, lesioni alla testa, e il processo di invecchiamento. La perdita di cellule ciliate sensoriali è una caratteristica patologica comune delle varietà di perdita dell'udito acquisita. Inoltre, la sinapsi delle cellule ciliate interne può essere danneggiata da lievi insulti. Pertanto, i preparati superficiali di epiteli cocleari, in combinazione con tecniche di immunoetichettatura e immagini confocali, sono uno strumento molto utile per lo studio di patologie cocleari, tra cui perdite di sinapsi del nastro e cellule ciliate sensoriali, cambiamenti nei livelli di proteine nelle cellule ciliate e nelle cellule di supporto, rigenerazione delle cellule dei capelli e determinazione dell'espressione genica del rapporto (cioè GFP) per la verifica della trasduzione e l'identificazione dei tipi di cellule trasdotte. La coclea, una struttura a spirale osa nell'orecchio interno, contiene l'organo finale sensoriale uditivo, l'organo di Corti (OC). Le cellule ciliate sensoriali e le cellule portante circostanti nell'OC sono contenute nel condotto cocleare e poggiano sulla membrana basilare, organizzate in modo tonotopico con rilevamento ad alta frequenza che si verifica nella base e a bassa frequenza nell'apice. Con la disponibilità di informazioni molecolari e genetiche e la capacità di manipolare i geni mediante tecniche di knockout e knock-in, i topi sono stati ampiamente utilizzati nella ricerca biologica, anche nella scienza dell'udito. Tuttavia, la coclea adulta del topo è minuscola, e l'epitelio cocleare è incapsulato in un labirinto osseo, rendendo difficile la microdissezione. Anche se le tecniche di dissezione sono state sviluppate e utilizzate in molti laboratori, questo metodo di microdissezione modificato utilizzando l'adesivo per cellule e tessuti è più facile e più conveniente. Può essere utilizzato in tutti i tipi di cocleari di topi adulti dopo la decalcificazione.
Introduzione
La coclea è dedicata alla rilevazione del suono e responsabile dell'udito. Il condotto cocleare è arrotolato a spirale nel labirinto osseo e detiene l'organo finale sensoriale uditivo, l'organo di Corti (OC). L'OC poggia sulla membrana basilare, che costituisce l'epitelio cocleare, con una lunghezza di circa 5,7 mm quando srotolato nei topi adulti CBA/CaJ1,2. Poiché l'OC è tonotopicamente organizzato con alte frequenze rilevate nella base e nelle basse frequenze nell'apice, l'epitelio cocleare è spesso diviso in tre parti per confronti analitici: i giri apicali, medi e basali corrispondenti a bassi, medio e ad....
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Protocollo
Tutti i protocolli di ricerca che coinvolgevano topi adulti maschi CBA/J all'età di 10-12 settimane e C57BL/6J topi all'età di 6-8 settimane sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la Medical University of South Carolina (MUSC). La cura degli animali era sotto la supervisione della Divisione delle risorse animali di laboratorio del MUSC.
NOT: Per le procedure presentate di seguito, i topi sono anestesizzati con ketamina (100 mg/kg) e xylazina (10 mg/kg) tramite iniezioni intraperitive. I topi vengono decapitati dopo che l'animale non risponde più a stimoli dolorosi, come un pizzic....
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Risultati
I preparati superficiali dell'epitelio cocleare, in combinazione con l'immunoetichettatura e l'imaging confocale, sono stati ampiamente utilizzati nella scienza dell'udito per lo studio di patologie cocleari, come la quantificazione delle sinapsi del nastro, le cellule ciliate sensoriali, ed espressione proteica nelle cellule ciliate sensoriali5,6,7,8. Anche se la dissezione delle cocleari di t.......
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Discussione
La microdissezione cocleare dei preparati superficiali a montaggio intero in combinazione con l'immunoetichettatura fornisce uno strumento di base per lo studio delle patologie dell'orecchio interno e dei meccanismi molecolari. Questo metodo di dissezione cocleare del topo adulto modificato utilizzando l'adesivo della cellula e del tessuto semplifica questa difficile procedura.
Anche se questo metodo di preparazione della superficie cocleare modificato è relativamente facile e accessibile, ric.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Il progetto di ricerca descritto è stato sostenuto dalla sovvenzione R01 DC009222 dell'Istituto Nazionale di Sordità e Altri Disturbi della Comunicazione, National Institutes of Health. Questo lavoro è stato condotto nel WR Building di MUSC in uno spazio ristrutturato supportato dalla sovvenzione C06 RR014516. Gli animali erano ospitati in strutture animali MUSC CRI supportate dalla sovvenzione C06 RR015455 dell'Extramural Research Facilities Program del National Center for Research Resources. Gli autori ringraziano il Dr. Jochen Schacht per i suoi preziosi commenti e Andra Talaska per la revisione del manoscritto.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| Vetrini coprioggetti Rund da 10 mm Prodotti | per microscopia per la scienza e l'industria | 260367 | |
| Alexa Fluor 488 Capra Anti-topo IgG2 | Thermo Fisher Scientific | A-21131 | |
| Alexa Fluor 488 Falloidina | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
| Alexa Fluor 594 Capra Anti-topo IgG1 | Thermo Fisher Scientific | A-21125 | |
| Alexa Fluor 594 Capra Anti-coniglio IgG (H+L) | Thermo Fisher Scientific | A11012 | |
| Vassoi per micro vetrini in cartone | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Cell-Tak | BD Biosciences | 354240 | |
| Piastre di Petri Corning | Fisher Scientific | 353004 | |
| DAPI | Thermo Fisher Scientific | 62247 | |
| Dumont #5 Pinze | Strumenti per le scienze fini FST | 11251-20 | |
| Sale disodico EDTA | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| Fluoro-gel con tampone Tris | Microscopia elettronica Scienze | 17985-10 | |
| Piastre per colture cellulari a quattro pozzetti | Greiner Bio-One | 627170 | |
| Anticorpo anti-miosina VIIa di capra | Proteus Biosciences | 25-6790 | |
| Vetrini per microscopio | Fisher Scientific | 12-544-7 | |
| Anticorpo anti-CtBP2 di topo | BD Biosciences | #612044 | |
| Anticorpo anti-Glu2R di topo | Millipore | MAB397 | |
| Siero di capra normale | Thermo Fisher Scientific | 31872 | |
| Paraformaldeide | Sigma-Aldrich | 441244 | |
| soluzione salina tamponata con fosfato | Fisher Scientific | BP665-1 | |
| Bisturi | VWR | 100491-038 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100-500ML | |
| Vannas Forbici a molla | Strumenti per la scienza fine | 15001-08 |
Riferimenti
- Muller, M., von Hunerbein, K., Hoidis, S., Smolders, J. W. A physiological place-frequency map of the cochlea in the CBA/J mouse. Hearing Research. 202 (1-2), 63-73 (2005).
- Viberg, A., Canlon, B. The guide to plotting a cochleogram. Hearing Research. 197 (1-10), (2004).
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Ristampe e permessi
