番茄根转化后与拉子托尼亚索拉纳卡鲁姆接种，直接遗传分析细菌性威尔特病
Summary
在这里，我们提出了一种用于番茄根转化的通用方法，然后用Ralstonia索兰卡鲁姆接种，对细菌枯萎病的研究进行直接的基因分析。
Abstract
拉托尼亚索兰卡鲁姆是一种毁灭性的土壤传播的血管病原体，可以感染大量的植物物种，对农业造成重大威胁。然而，与涉及细菌植物病原体的其他模型相比，Ralstonia模型被开发起来要少得多，例如阿拉伯的伪莫纳斯西林加。旨在了解Ralstonia和作物植物之间的相互作用的研究对于开发对抗细菌枯萎病的可持续解决方案至关重要，但目前由于缺乏简单的实验测定来描述本地宿主植物中相互作用的不同成分，目前受到阻碍。在这种情况下，我们开发了一种方法来对拉子托尼亚的番茄感染进行基因分析，番茄是Ralstonia的天然宿主。该方法基于农业细菌根-介导的番茄根转化，其次是Ralstonia土壤浸湿接种的结果植物，包含转化的根表示利益的构造。根转化测定的多功能性允许执行由RNAi介导的基因过度表达或基因沉默。作为概念的证明，我们用这种方法来证明，在番茄根部，RNAi介导的SlCESA6的沉默对Ralstonia具有抵抗力。在这里，我们详细介绍了这种方法，使遗传方法能够在相对较短的时间内了解细菌枯萎病，对设备和植物生长空间的要求很小。
Introduction
Ralstonia Solanacearum是细菌枯萎病的病因，是一种毁灭性的土壤传播的血管病原体，其分布范围广泛，可感染多种植物，包括马铃薯、番茄、烟草、香蕉、胡椒和茄子等。,2根据品种、气候、土壤等因素，马铃薯、马铃薯、香蕉等产量损失可达番茄、马铃薯、香蕉产量的80-90%。然而，与涉及细菌植物病原体的其他模型相比，Ralstonia模型被开发起来相当不足，例如伪莫纳斯西林加或Xanthomonas spp。此外，大多数植物-微生物相互作用的研究都集中在植物阿拉比多普西斯塔利亚纳模型上。尽管使用这些模型的研究在很大程度上有助于我们理解植物-细菌之间的相互作用，但它们并没有解决目前理解作物植物中这些相互作用的必要性。旨在了解Ralstonia和作物植物之间的相互作用的研究对于开发对抗细菌枯萎病的可持续解决方案至关重要，但目前由于缺乏简单的实验测定来描述相互作用的不同成分，目前受到阻碍。特别是，番茄是Ralstonia的天然宿主，是全球第二大蔬菜作物，受到包括细菌枯萎病在内的大量疾病的影响。在这项工作中，我们开发了一种简单的方法，对番茄的Ralstonia感染进行基因分析。该方法基于甘氏菌根-介导的番茄根转化，使用DsRed荧光作为选择标记5，然后拉氏土壤浸湿接种的结果植物，包含转化的根表示利益的构造。根转化测定的多功能性允许执行由RNAi介导的基因过度表达或基因沉默。
此方法的潜在限制在于非转化根的残余增长。这在使用的质粒缺少允许选择转化根的报体基因的情况下尤其重要。为了解决这个问题，我们开发了一种基于抗生素选择的替代方法，它抑制了非转化根的生长，同时允许健康耐抗生素转化根的生长。由于A.根茎不诱导芽的转化，它们容易受到抗生素的影响，因此，它们应该与含抗生素的介质分开。
虽然植物对Ralstonia的抗药性并不十分了解，但一些报告将细胞壁改变与细菌枯萎的抵抗力增强有关66、7、8、9。7,8,9有人建议，这些细胞壁改变影响血管发育，在植物10内，Ralstonia的生活方式的一个重要方面。编码纤维素合成酶CESA4、CESA7和CESA8的基因突变已被证明会损害继发细胞壁的完整性，导致对Ralstonia的抵抗力增强，这似乎与ABA信号8有关。 CESA7因此，作为我们方法的概念证明，我们进行了RNAi介导的SlCESA6（Solyc02g072240），一种继细胞壁纤维素合成酶，以及AtCESA8（At4g18780）的正交At4g18780。 SlCESA6 Solyc02g072240随后用Ralstonia进行土壤浸渍的接种表明，沉默SlCESA6增强了对细菌枯萎症状的抵抗力，这表明细胞壁介导的对Ralstonia的抗药性很可能在番茄中得到保存，并验证了我们对番茄根部细菌枯萎耐药性进行基因分析的方法。在这里，我们详细介绍了这种方法，使遗传方法能够在相对较短的时间内了解细菌枯萎病，对设备和植物生长空间的要求很小。
Protocol
Representative Results
Discussion
拉尔斯托尼亚·索纳萨鲁姆对农业构成重要威胁;然而，与其他细菌病原体相比，它与其他细菌病原体（特别是在作物植物物种中）相比，与具有农业重要性的自然宿主的相互作用仍然知之甚少。在大多数情况下，基因分析受到基因改造宿主植物所需的时间和费用的阻碍。为了解决这个问题，促进番茄中拉索纳卡鲁姆感染的基因分析，我们开发了一种基于植物原体-番茄根介导转…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢马乔实验室的所有实验室成员进行了有益的讨论，阿尔瓦罗·洛佩斯-加西亚提供了统计建议，并感谢新宇健在这项工作中提供技术和行政协助。我们感谢PSC细胞生物学核心设施在荧光成像方面的援助，这项工作得到了中国科学院战略优先研究项目（授予XDB27040204）、上海植物压力生物学中心（中国中国科学院）和中国千名人才计划。
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
Riferimenti
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