Tomatrod Transformation Efterfulgt af podning med Ralstonia Solanacearum for ligetil genetisk analyse af bakteriel visnesygdom
Summary
Her præsenterer vi en alsidig metode til tomatrodtransformation efterfulgt af podning med Ralstonia solanacearum for at udføre ligetil genetisk analyse til undersøgelse af bakteriel visnesygdom.
Abstract
Ralstonia solanacearum er en ødelæggende jordbårne vaskulære patogen, der kan inficere en lang række plantearter, der forårsager en betydelig trussel mod landbruget. Men, Ralstonia model er betydeligt underudforsket i forhold til andre modeller, der involverer bakterielle plante patogener, såsom Pseudomonas syringae i Arabidopsis. Forskning, der er målrettet mod at forstå samspillet mellem Ralstonia og afgrødeplanter, er afgørende for at udvikle bæredygtige løsninger til bekæmpelse af bakteriel leflen, men er i øjeblikket hæmmet af manglen på enkle eksperimentelle analyser for at karakterisere de forskellige komponenter i samspillet i indfødte værtsplanter. I dette scenario har vi udviklet en metode til at udføre genetisk analyse af Ralstonia infektion af tomat, en naturlig vært for Ralstonia. Denne metode er baseret på Agrobacterium rhizogenes-medieret transformation af tomat rødder, efterfulgt af Ralstonia jord-drenching podning af de resulterende planter, der indeholder transformerede rødder udtrykke konstruktion af interesse. Alsidigheden af rodtransformationsanalysen gør det muligt at udføre enten genoverekspression eller genhæmning medieret af RNAi. Som et proof of concept, vi brugte denne metode til at vise, at RNAi-medieret lyddæmpning af SlCESA6 i tomat rødder gav resistens over for Ralstonia. Her beskriver vi denne metode i detaljer, så genetiske tilgange til at forstå bakteriel visne sygdom i en relativt kort tid og med små krav til udstyr og plantevækst plads.
Introduction
Ralstonia solanacearum, årsagssammenhæng agent for bakteriel visne sygdom, er en ødelæggende jordbårne vaskulære patogen med en verdensomspændende fordeling, der kan inficere en lang række plantearter, herunder kartoffel, tomat, tobak, banan, peber og aubergine, blandt andre1,2. Udbyttetab forårsaget af Ralstonia kan nå 80-90% af produktionen i tomat, kartoffel eller banan, afhængigt af sort, klima, jord og andre faktorer3. Men, Ralstonia model er betydeligt underudforsket i forhold til andre modeller, der involverer bakterielle plante patogener, såsom Pseudomonas syringae eller Xanthomonas spp. Derudover er de fleste undersøgelser i plante-mikrobe interaktioner fokuseret på modellen plante Arabidopsis thaliana. Selv om forskning ved hjælp af disse modeller i høj grad har bidraget til vores forståelse af plante-bakterier interaktioner, de ikke løse den nuværende nødvendighed for at forstå disse interaktioner i afgrøder planter. Forskning, der er målrettet mod at forstå samspillet mellem Ralstonia og afgrødeplanter, er afgørende for at udvikle bæredygtige løsninger til bekæmpelse af bakteriel leflen, men er i øjeblikket hæmmet af manglen på enkle eksperimentelle analyser, der karakteriserer de forskellige komponenter i interaktionen. Især tomat, en naturlig vært for Ralstonia, er den næstvigtigste vegetabilske afgrøde på verdensplan og er ramt af en overflod af sygdomme4, herunder bakteriel visne sygdom. I dette arbejde har vi udviklet en nem metode til at udføre genetisk analyse af Ralstonia infektion af tomat. Denne metode er baseret på Agrobacterium rhizogenes-medieret transformation af tomat rødder, ved hjælp af DsRed fluorescens som udvælgelse markør5, efterfulgt af Ralstonia jord-drenching podning af de resulterende planter, der indeholder transformerede rødder udtrykke konstruktion af interesse. Alsidigheden af rodtransformationsanalysen gør det muligt at udføre enten genoverekspression eller genhæmning medieret af RNAi.
En potentiel begrænsning af denne metode består i den resterende vækst af ikke-transformerede rødder. Dette er især vigtigt i de tilfælde, hvor plasmid anvendes mangler en reporter gen, der tillader udvælgelse af omdannede rødder. For at løse dette problem har vi udviklet en alternativ metode baseret på antibiotikaudvælgelse, som hæmmer væksten af ikke-transformerede rødder, samtidig med at vi tillader vækst af sunde antibiotikaresistente transformerede rødder. Da A. rhizogenes ikke fremkalder omdannelse af skud, er de modtagelige for antibiotika, og de bør derfor holdes adskilt fra det antibiotiske medium.
Selv om plantenmodstand mod Ralstonia ikke er godt forstået, har flere rapporter forbundet cellevæg ændringer til øget resistens over for bakteriel visne6,7,8,9. Det er blevet foreslået, at disse cellevæg ændringer påvirker vaskulær udvikling, et væsentligt aspekt for livsstil Ralstonia inde i anlægget10. Mutationer i gener, der koder cellulosesynthaserne CESA4, CESA7 og CESA8 i Arabidopsis thaliana, har vist sig at forringe sekundære cellevægintegritet, hvilket medfører øget resistens over for Ralstonia, som synes at være forbundet med ABA-signalering8. Derfor, som et proof of concept for vores metode, udførte vi RNAi-medieret genhæmning af SlCESA6 (Solyc02g072240), en sekundær celle-væg cellulose syntase, og ortolog af AtCESA8 (At4g18780). Efterfølgende jord-drenching vaccination med Ralstonia viste, at lyddæmpning SlCESA6 øget resistens over for bakterielle visne symptomer, hvilket tyder på, at celle væg-medieret resistens over for Ralstonia sandsynligvis bevares i tomat, og validering af vores metode til at udføre genetisk analyse af bakteriel visneresistens i tomat rødder. Her beskriver vi denne metode i detaljer, så genetiske tilgange til at forstå bakteriel visne sygdom i en relativt kort tid og med små krav til udstyr og plantevækst plads.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum udgør en stor trussel mod landbruget. men dens interaktion med naturlige værter af landbrugsbetydning er stadig dårligt forstået sammenlignet med andre bakterielle patogener, især i plantearter. I de fleste tilfælde hæmmes genetisk analyse af den tid og de udgifter, der er nødvendige for at genetisk modificere værtsplanter. For at løse dette problem og lette genetisk analyse af R. solanacearum infektion i tomat, har vi udviklet en nem metode baseret på Agrobacterium…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle lab medlemmer af Macho laboratorium for nyttige diskussioner, Alvaro López-García for statistisk rådgivning, og Xinyu Jian for teknisk og administrativ bistand under dette arbejde. Vi takker PSC Cell Biology kernefacilitet for bistand med fluorescens imaging Dette arbejde blev støttet af den strategiske prioritet Forskningsprogram af den kinesiske Academy of Sciences (tilskud XDB27040204), Shanghai Center for Plant Stress Biology (kinesisk Academy of Sciences) og det kinesiske 1000 Talents program.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
Riferimenti
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
