Tomatenwurzeltransformation gefolgt von Impfung mit Ralstonia Solanacearum für einfache genetische Analyse der bakteriellen Wilt-Krankheit
Summary
Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode zur Tomatenwurzeltransformation, gefolgt von der Impfung mit Ralstonia solanacearum, um eine einfache genetische Analyse für die Untersuchung von bakteriellen Wilt-Erkrankungen durchzuführen.
Abstract
Ralstonia solanacearum ist ein verheerender, durch den Boden übertragener Vasoren, der eine Große Auswahl an Pflanzenarten infizieren kann und eine wichtige Bedrohung für die Landwirtschaft darstellt. Allerdings ist das Ralstonia-Modell im Vergleich zu anderen Modellen mit bakteriellen Pflanzenpathogenen, wie Pseudomonas syringae di Arabidopsis,erheblich untererforscht. Forschung auf das Verständnis der Wechselwirkung zwischen Ralstonie und Pflanzen ist wichtig, um nachhaltige Lösungen zur Bekämpfung der bakteriellen Wilt-Krankheit zu entwickeln, wird aber derzeit durch das Fehlen von einfachen experimentellen Assays behindert, um die verschiedenen Komponenten der Interaktion in einheimischen Wirtspflanzen zu charakterisieren. In diesem Szenario haben wir eine Methode entwickelt, um eine genetische Analyse der Ralstonie-Infektion von Tomaten durchzuführen, einem natürlichen Wirt von Ralstonien. Diese Methode basiert auf Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Umwandlung von Tomatenwurzeln, gefolgt von Ralstonia Boden-drenching Inokulation der resultierenden Pflanzen, die transformierte Wurzeln, die das Konstrukt des Interesses auszudrücken. Die Vielseitigkeit des Wurzeltransformationstests ermöglicht die Durchführung von Genüberexpression oder Gen-Silencing, die von RNAi vermittelt wird. Als Proof of Concept haben wir diese Methode verwendet, um zu zeigen, dass RNAi-vermitteltes Silencing von SlCESA6 in Tomatenwurzeln RalstonieResistenzverleiht. Hier beschreiben wir diese Methode im Detail, die es genetischen Ansätzen ermöglicht, bakterielle Wildeskrankheiten in relativ kurzer Zeit und mit geringen Anforderungen an Ausrüstung und Pflanzenwachstumsraum zu verstehen.
Introduction
Ralstonia solanacearum, der Erreger der bakteriellen Wilt-Krankheit, ist ein verheerender bodenübertragener Vasor mit einer weltweiten Verbreitung, die eine große Auswahl an Pflanzenarten infizieren kann, darunter Kartoffeln, Tomaten, Tabak, Banane, Pfeffer und Auberginen, unter anderem1,2. Ertragsverluste durch Ralstonie können 80-90% der Produktion in Tomaten, Kartoffeln oder Bananen erreichen, abhängig von Sorte, Klima, Boden und anderen Faktoren3. Allerdings ist das Ralstonia-Modell im Vergleich zu anderen Modellen mit bakteriellen Pflanzenpathogenen, wie Pseudomonas syringae oder Xanthomonas spp,erheblich untererforscht. Darüber hinaus konzentrieren sich die meisten Studien in Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen auf die Modellpflanze Arabidopsis thaliana. Obwohl die Forschung, die diese Modelle verwendet, weitgehend zu unserem Verständnis von Pflanzen-Bakterien-Wechselwirkungen beigetragen hat, gehen sie nicht auf die aktuelle Notwendigkeit ein, diese Wechselwirkungen in Kulturpflanzen zu verstehen. Forschung, die auf das Verständnis der Wechselwirkung zwischen Ralstonie und Pflanzen ausgerichtet ist, ist wichtig, um nachhaltige Lösungen zur Bekämpfung der bakteriellen Wilt-Krankheit zu entwickeln, wird aber derzeit durch das Fehlen von einfachen experimentellen Assays behindert, um die verschiedenen Komponenten der Interaktion zu charakterisieren. Insbesondere Tomate, ein natürlicher Wirt für Ralstonie,ist die zweitwichtigste Gemüsepflanze weltweit und wird von einer Vielzahl von Krankheiten4, einschließlich bakterieller Wilt-Krankheit betroffen. In dieser Arbeit haben wir eine einfache Methode entwickelt, um genetische Analysen der Ralstonie-Infektion von Tomaten durchzuführen. Diese Methode basiert auf Agrobacterium rhizogenes-vermittelte Transformation von Tomatenwurzeln, mit DsRed Fluoreszenz als Selektionmarker5, gefolgt von Ralstonia Boden-drenching Inokulation der resultierenden Pflanzen, enthält transformierte Wurzeln, die das Konstrukt des Interesses. Die Vielseitigkeit des Wurzeltransformationstests ermöglicht die Durchführung von Genüberexpression oder Gen-Silencing, die von RNAi vermittelt wird.
Eine mögliche Einschränkung dieser Methode besteht in dem Restwachstum nicht transformierter Wurzeln. Dies ist besonders wichtig in den Fällen, in denen das verwendete Plasmid kein Reportergen hat, das die Auswahl transformierter Wurzeln ermöglicht. Um dieses Problem zu lösen, haben wir eine alternative Methode entwickelt, die auf der Antibiotikaauswahl basiert, die das Wachstum nicht transformierter Wurzeln hemmt und gleichzeitig das Wachstum gesunder antibiotikaresistenter transformierter Wurzeln ermöglicht. Da A. rhizogenes die Umwandlung von Trieben nicht induziert, sind sie anfällig für das Antibiotikum, und daher sollten sie vom antibiotikahaltigen Medium getrennt gehalten werden.
Obwohl die Pflanzenresistenz gegen Ralstonie nicht gut verstanden wird, haben mehrere Berichte Zellwandveränderungen mit einer verbesserten Resistenz gegen bakterielle swilt6,7,8,9. Es wurde vorgeschlagen, dass diese Zellwandveränderungen die Gefäßentwicklung beeinflussen, ein wesentlicher Aspekt für den Lebensstil von Ralstonia innerhalb der Pflanze10. Mutationen in Genen, die für die Cellulose-Synthasen CESA4, CESA7 und CESA8 di Arabidopsis thaliana kodieren, haben gezeigt, dass sie die sekundäre Zellwandintegrität beeinträchtigen und eine erhöhte Resistenz gegen Ralstoniaverursachen, die mit der ABA-Signalisierung8verbunden zu sein scheint. Daher haben wir als Proof of Concept für unsere Methode RNAi-vermittelte Gen-Silencing von SlCESA6 (Solyc02g072240), einer sekundären Zellwand-Zellulose-Synthase und einem Ortholog von AtCESA8 (At4g18780) durchgeführt. Die anschließende bodendurchflutete Impfung mit Ralstonie zeigte, dass das Silencing SlCESA6 die Resistenz gegen bakterielle Wilt-Symptome erhöhte, was darauf hindeutet, dass die zellwandvermittelte Resistenz gegen Ralstonie wahrscheinlich in Tomaten konserviert wird, und unsere Methode zur Durchführung genetischer Analysen der bakteriellen Wilkresistenz in Tomatenwurzeln validiert. Hier beschreiben wir diese Methode im Detail, die es genetischen Ansätzen ermöglicht, bakterielle Wildeskrankheiten in relativ kurzer Zeit und mit geringen Anforderungen an Ausrüstung und Pflanzenwachstumsraum zu verstehen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum stellt eine wichtige Bedrohung für die Landwirtschaft dar; Seine Wechselwirkung mit natürlichen Wirten von landwirtschaftlicher Bedeutung ist jedoch im Vergleich zu anderen bakteriellen Krankheitserregern, insbesondere bei Pflanzenarten, noch immer wenig verstanden. In den meisten Fällen wird die genetische Analyse durch die Zeit und die Kosten behindert, die für die genetische Veränderung von Wirtspflanzen erforderlich sind. Um dieses Problem anzugehen und die genetische Analyse der …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken allen Labormitgliedern des Macho-Labors für die hilfreichen Diskussionen, Alvaro Lépez-Garcéa für statistische Ratschläge und Xinyu Jian für die technische und administrative Unterstützung während dieser Arbeit. Wir danken der PSC Cell Biology Kerneinrichtung für die Unterstützung bei der Fluoreszenzbildgebung Diese Arbeit wurde durch das Strategic Priority Research Program der Chinese Academy of Sciences (Grant XDB27040204), das Shanghai Center for Plant Stress Biology (Chinesisch) unterstützt. Akademie der Wissenschaften) und das chinesische 1000 Talents-Programm.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
Riferimenti
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