Tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia Solanacearum for enkel genetisk analyse av bakteriell wiltsykdom
Summary
Her presenterer vi en allsidig metode for tomatrottransformasjon etterfulgt av inokulasjon med Ralstonia solanacearum for å utføre enkel genetisk analyse for studiet av bakteriell wilt sykdom.
Abstract
Ralstonia solanacearum er et ødeleggende jordbåren vaskulært patogen som kan infisere et stort utvalg av plantearter, noe som forårsaker en viktig trussel mot landbruket. Ralstonia-modellen er imidlertid betydelig underutforsket i forhold til andre modeller som involverer bakterielle plantepatogener, som Pseudomonas syringae i Arabidopsis. Forskning rettet mot å forstå samspillet mellom Ralstonia og avlingsanlegg er avgjørende for å utvikle bærekraftige løsninger for å bekjempe bakteriell wilt sykdom, men er for tiden hindret av mangel på enkle eksperimentelle analyser for å karakterisere de ulike komponentene i samspillet i innfødte vertsplanter. I dette scenariet har vi utviklet en metode for å utføre genetisk analyse av Ralstonia infeksjon av tomat, en naturlig vert for Ralstonia. Denne metoden er basert på Agrobacterium rhizogenes-mediert transformasjon av tomatrøtter, etterfulgt av Ralstonia jord-drenching inokulasjon av de resulterende plantene, som inneholder forvandlede røtter som uttrykker konstruksjonen av interesse. Allsidigheten til rottransformasjonsanalysen gjør det mulig å utføre enten genoveruttrykk eller gendeaktivering mediert av RNAi. Som et konseptbevis brukte vi denne metoden til å vise at RNAi-mediert deaktivering av SlCESA6 i tomatrøtter ga motstand mot Ralstonia. Her beskriver vi denne metoden i detalj, slik at genetiske tilnærminger til å forstå bakteriell wilt sykdom på relativt kort tid og med små krav til utstyr og plantevekstplass.
Introduction
Ralstonia solanacearum, årsaksmidlet av bakteriell wilt sykdom, er et ødeleggende jordbåren vaskulær patogen med en verdensomspennende fordeling som kan infisere et stort utvalg av plantearter, inkludert potet, tomat, tobakk, banan, pepper og aubergine, blant annet1,2. Yield tap forårsaket av Ralstonia kan nå 80-90% av produksjonen i tomat, potet eller banan, avhengig av sort, klima, jord og andre faktorer3. Ralstonia-modellen er imidlertid betydelig underutforsket i forhold til andre modeller som involverer bakterielle plantepatogener, for eksempel Pseudomonas syringae eller Xanthomonas spp. I tillegg er de fleste studier i plantemikrobeinteraksjoner fokusert på modellanlegget Arabidopsis thaliana. Selv om forskning ved hjelp av disse modellene i stor grad har bidratt til vår forståelse av plantebakterier interaksjoner, de ikke ta opp dagens nødvendighet for å forstå disse interaksjonene i avlingplanter. Forskning rettet mot å forstå samspillet mellom Ralstonia og avlingsanlegg er avgjørende for å utvikle bærekraftige løsninger for å bekjempe bakteriell wilt sykdom, men er for tiden hindret av mangel på enkle eksperimentelle analyser for å karakterisere de ulike komponentene i samspillet. Spesielt tomat, en naturlig vert for Ralstonia, er den nest viktigste vegetabilske avlingen over hele verden og påvirkes av en mengde sykdommer4, inkludert bakteriell wilt sykdom. I dette arbeidet har vi utviklet en enkel metode for å utføre genetisk analyse av Ralstonia infeksjon av tomat. Denne metoden er basert på Agrobacterium rhizogenes-mediert transformasjon av tomatrøtter, ved hjelp av DsRed fluorescens som utvalgsmarkør5, etterfulgt av Ralstonia jord-drenching inokulasjon av de resulterende plantene, som inneholder forvandlede røtter som uttrykker konstruksjonen av interesse. Allsidigheten til rottransformasjonsanalysen gjør det mulig å utføre enten genoveruttrykk eller gendeaktivering mediert av RNAi.
En potensiell begrensning av denne metoden består på gjenværende vekst av ikke-forvandlede røtter. Dette er spesielt viktig i de tilfellene hvor plasmidbrukt mangler et reportergen som gjør det mulig å velge transformerte røtter. For å løse dette problemet har vi utviklet en alternativ metode basert på antibiotikavalg, som hemmer veksten av ikke-forvandlede røtter samtidig som veksten av sunne antibiotikaresistente forvandlede røtter. Siden A. rhizogenes ikke induserer transformasjonen av skudd, er de utsatt for antibiotika, og derfor bør de holdes atskilt fra det antibiotikaholdige mediet.
Selv om plantemotstand mot Ralstonia ikke er godt forstått, har flere rapporter tilhørende celleveggendringer til økt motstand mot bakteriell wilt6,7,8,9. Det har blitt foreslått at disse celleveggendringene påvirker vaskulær utvikling, et viktig aspekt for livsstilen til Ralstonia inne i anlegget10. Mutasjoner i gener som koder cellulosesynthasene CESA4, CESA7 og CESA8 i Arabidopsis thaliana har vist seg å svekke sekundær celleveggintegritet, noe som forårsaker økt motstand mot Ralstonia, som synes å være knyttet til ABA-signalering8. Derfor, som et bevis på konseptet for vår metode, utførte vi RNAi-mediert gendeaktivering av SlCESA6 (Solyc02g072240), en sekundær celleveggcellulose synthase, og ortholog av AtCESA8 (At4g18780). Påfølgende jord-drenching inokulasjon med Ralstonia viste at deaktivering Av SlCESA6 forbedret motstand mot bakterielle wilt symptomer, noe som tyder på at celle veggmediert motstand mot Ralstonia er sannsynlig bevart i tomat, og validere vår metode for å utføre genetisk analyse av bakteriell wilt resistens i tomat røtter. Her beskriver vi denne metoden i detalj, slik at genetiske tilnærminger til å forstå bakteriell wilt sykdom på relativt kort tid og med små krav til utstyr og plantevekstplass.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum utgjør en viktig trussel mot landbruket; Men samspillet med naturlige verter av landbruksbetydning er fortsatt dårlig forstått sammenlignet med andre bakterielle patogener, spesielt i planteplantearter. I de fleste tilfeller er genetisk analyse hindret av tid og utgifter som kreves for å genetisk modifisere vertsplanter. For å løse dette problemet og lette genetisk analyse av R. solanacearum infeksjon i tomat, har vi utviklet en enkel metode basert på Agrobacterium rhiz…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker alle laboratoriemedlemmer av Macho-laboratoriet for nyttige diskusjoner, Alvaro López-García for statistisk rådgivning, og Xinyu Jian for teknisk og administrativ hjelp under dette arbeidet. Vi takker KJERNEanlegget for PSC Cell Biology for hjelp med fluorescensavbildning Dette arbeidet ble støttet av Strategic Priority Research Program for det kinesiske vitenskapsakademiet (gi XDB27040204), Shanghai Center for Plant Stress Biology (kinesisk Academy of Sciences) og det kinesiske 1000 Talents-programmet.
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
Riferimenti
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
