Qui, presentiamo un metodo versatile per la trasformazione della radice di pomodoro seguito da inoculazione con Ralstonia solanacearum per eseguire un'analisi genetica semplice per lo studio della malattia dell'avvizzimento batterico.
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Articolo metodologico
Trasformazione della radice di pomodoro seguita da inoculazione con Ralstonia Solanacearum per un'analisi genetica diretta della malattia batterica di Wilt
In questo articolo
Sommario
Abstract
Ralstonia solanacearum è un devastante patogeno vascolare portato sul suolo che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, causando un'importante minaccia per l'agricoltura. Tuttavia, il modello ralstonia è notevolmente sottoesplorato rispetto ad altri modelli che coinvolgono patogeni vegetali batterici, come le siringhe Pseudomonas in Arabidopsis. La ricerca mirata a comprendere l'interazione tra Ralstonia e piante da coltura è essenziale per sviluppare soluzioni sostenibili per combattere le malattie dell'avvistamento batterico, ma è attualmente ostacolata dalla mancanza di semplici analisi sperimentali per caratterizzare i diversi componenti dell'interazione nelle piante ospiti native. In questo scenario, abbiamo sviluppato un metodo per eseguire l'analisi genetica dell'infezione da Ralstonia del pomodoro, un ospite naturale di Ralstonia. Questo metodo si basa sulla trasformazione mediata di radici di pomodoro agrobacterium rhizogenes,seguita dall'inoculazione del suolo ralstonia delle piante risultanti, contenente radici trasformate che esprimono il costrutto di interesse. La versatilità dell'analisi della trasformazione della radice consente di eseguire la sovraespressione genica o il silenziamento genico mediato dall'RNAi. Come prova di concetto, abbiamo usato questo metodo per dimostrare che il silenziamento mediato dall'RNAi di SlCESA6 nelle radici di pomodoro ha conferito resistenza a Ralstonia. Qui, descriviamo questo metodo in dettaglio, consentendo agli approcci genetici di comprendere la malattia dell'avvizzimento batterico in un tempo relativamente breve e con piccoli requisiti di attrezzature e spazio di crescita delle piante.
Introduzione
Ralstonia solanacearum, l'agente causale della malattia dell'avvistamento batterico, è un devastante patogeno vascolare del suolo con una distribuzione mondiale che può infettare una vasta gamma di specie vegetali, tra cui patate, pomodoro, tabacco, banana, pepe e melanzane, tra gli altri1,2. Le perdite di rendimento causate da Ralstonia possono raggiungere l'80-90% della produzione di pomodoro, patate o banane, a seconda della cultivar, del clima, del suolo e di altri fattori3. Tuttavia, il modello Ralstonia è notevolmente poco esplorato rispetto ad altri mod....
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Protocollo
NOTA: Parti importanti di questo metodo riguardano la movimentazione di materiali vegetali in vitro, e quindi è importante mantenere le condizioni sterili durante tutte queste procedure, compresa la visualizzazione della fluorescenza DsRed. Durante tutto il processo di trasformazione, le piantine di pomodoro crescono a 25-28 gradi centigradi e 16 h/8 h luce/scuro (130 fotoni mol m-2s-1 luce). Le piastre sono sigillate con nastro microporo per facilitare lo scambio di gas e la traspirazione.
1. Preparazione di piante di pomodoro e agrobacterium rhizogenes
- Sterilizzare i semi di pomod....
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Risultati
La figura 5 mostra lo sviluppo dei sintomi della malattia delle piante di pomodoro con radici trasformate con un vettore vuoto (EV) e di piante con radici trasformate con un costrutto RNAi destinato a SlCESA6 (Solyc02g072240). I dati dell'indice della malattia (Figura 5A) vengono raccolti dalla stessa unità sperimentale (ogni impianto) nel tempo secondo una scala arbitraria da 0 a 4 e non seguon.......
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Discussione
Il Ralstonia solanacearum rappresenta una minaccia importante per l'agricoltura; tuttavia, la sua interazione con ospiti naturali di importanza agricola è ancora poco compresa rispetto ad altri patogeni batterici, specialmente nelle specie vegetali delle colture. Nella maggior parte dei casi, l'analisi genetica è ostacolata dal tempo e dalle spese necessarie per modificare geneticamente le piante ospiti. Per risolvere questo problema e facilitare l'analisi genetica dell'infezione da R. solanacearum nel .......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Ringraziamo tutti i membri del laboratorio Macho per le discussioni utili, Alvaro Lopez-Garcoa per la consulenza statistica e Xinyu Jian per l'assistenza tecnica e amministrativa durante questo lavoro. Ringraziamo la struttura centrale di PSC Cell Biology per assistenza con l'imaging a fluorescenza Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca Sulla Priorità Strategica dell'Accademia Cinese delle Scienze (grant XDB27040204), lo Shanghai Center for Plant Stress Biology (Cinese Academy of Sciences) e il programma cinese 1000 Talents.
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| di Petri quadrate da 90 mm | |||
| Polvere di agar | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton e Dickinson) | ||
| Acidi Casamino | Sigma-Aldrich | ||
| Carta | |||
| Sistema di imaging vegetale in vivo NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Vasi Jiffy | Jiffy Products International A.S. | ||
| Nastro microporoso | 3M | ||
| Murashige e Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrato | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Bisturi e lama | |||
| Ipoclorito di sodio | Sigma-Aldrich | ||
| Banco | |||
| Pinzetta | |||
| Wahtman carta | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Estratto di lievito | OXOID |
Riferimenti
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549(2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.
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Ristampe e permessi
