Томатный корень Преобразование После прививки с Ralstonia Solanacearum для straightforward генетического анализа бактериальной болезни Wilt
Summary
Здесь мы представляем универсальный метод для преобразования корня томатов после прививки с Ralstonia solanacearum для выполнения простого генетического анализа для изучения бактериального заболевания увядания.
Abstract
Ralstonia solanacearum является разрушительным почвенных сосудистых патогенов, которые могут инфицировать большой спектр видов растений, вызывая важную угрозу для сельского хозяйства. Тем не менее, модель Ralstonia значительно недостаточно изучена по сравнению с другими моделями с участием бактериальных растительных патогенов, таких как Pseudomonas шприцев в Arabidopsis. Исследования, направленные на понимание взаимодействия между Ralstonia и растениеводства имеет важное значение для разработки устойчивых решений для борьбы с бактериальной болезнью увядания, но в настоящее время препятствует отсутствие простых экспериментальных анализов для характеристики различных компонентов взаимодействия в местных растений-хозяев. В этом сценарии, мы разработали метод для выполнения генетического анализа Ralstonia инфекции помидоров, естественный хозяин Ralstonia. Этот метод основан на агробактерии rhizogenes-опосредоченнойтрансформации томатных корней, а затем Ralstonia почво-заливание прививки результирующих растений, содержащие преобразованные корни, выражающие конструкцию интереса. Универсальность ассея преобразования корня позволяет выполнять либо генную переэкспрессию, либо заглушку генов, опосредованные РНК. В качестве доказательства концепции, мы использовали этот метод, чтобы показать, что РНК-опосредованного замалчивания SlCESA6 в томатных корней присваивал сопротивление Ralstonia. Здесь мы подробно описываем этот метод, позволяющий генетическим подходам понимать бактериальное заболевание увядание за относительно короткое время и с небольшими требованиями оборудования и пространства роста растений.
Introduction
Ralstonia solanacearum, причинно-следственный агент бактериального увядания болезни, является разрушительным почвенных сосудистых патогенов с мировым распространением, которые могут заразить широкий спектр видов растений, в том числе картофель, помидоры, табак, банан, перец и баклажаны, среди других1,2. Потери урожайности, вызванные Ralstonia может достигать 80-90% производства в томате, картофеле или банане, в зависимости от сорта, климата, почвы и других факторов3. Тем не менее, модель Ralstonia значительно недостаточно изучена по сравнению с другими моделями с участием бактериальных растительных патогенов, таких как Pseudomonas шприцев или Xanthomonas spp. Кроме того, большинство исследований в растительно-микробных взаимодействий сосредоточены на модели завода Arabidopsis thaliana. Хотя исследования с использованием этих моделей в значительной степени способствовали нашему пониманию взаимодействия растений и бактерий, они не решают текущую необходимость понять эти взаимодействия в растениеводстве. Исследования, направленные на понимание взаимодействия между Ralstonia и растениеводства имеет важное значение для разработки устойчивых решений для борьбы с бактериальными болезнями увядания, но в настоящее время препятствует отсутствие простых экспериментальных анализов для характеристики различных компонентов взаимодействия. В частности, помидор, естественный хозяин для Ralstonia, является вторым по значимости овощной культурой во всем мире и зависит от множества заболеваний4, в том числе бактериальной болезни увядания. В этой работе мы разработали простой метод для выполнения генетического анализа инфекции Ralstonia помидоров. Этот метод основан на Agrobacteriumrhizogenes-опосредоченной трансформации томатных корней, используя DsRed флуоресценции в качестве маркера отбора5, а затем Ralstonia почво-залитой прививки результирующих растений, содержащих преобразованные корни, выражающие конструкцию интереса. Универсальность ассея преобразования корня позволяет выполнять либо генную переэкспрессию, либо заглушку генов, опосредованные РНК.
Потенциальное ограничение этого метода заключается в остаточном росте непреобразованных корней. Это особенно важно в тех случаях, когда плазмида используется не хватает репортера гена, который позволяет выбор преобразованных корней. Для решения этой проблемы мы разработали альтернативный метод, основанный на отборе антибиотиков, который тормозит рост непреобразованных корней, позволяя при этом расти здоровыми устойчивыми к антибиотикам трансформированными корнями. Так как A. rhizogenes не вызывает трансформацию побегов, они восприимчивы к антибиотику, и, следовательно, они должны быть отделены от антибиотикосодержащей среды.
Хотя сопротивление растений против Ralstonia не очень хорошо понимается, несколько докладов связаны изменения клеточной стенки к повышенной устойчивости к бактериальной увядание6,7,8,9. Было высказано предположение, что эти изменения клеточной стенки влияют на развитие сосудов, важным аспектом для образа жизни Ralstonia внутри растения10. Мутации в генах, кодирующих целлюлозные синтазы CESA4, CESA7 и CESA8 в Arabidopsis thaliana, как было показано, ухудшают целостность вторичной клеточной стенки, вызывая повышенную устойчивость к Ralstonia, который, как представляется, связан с ABA сигнализации8. Таким образом, в качестве доказательства концепции для нашего метода, мы выполнили РНК-опосредованного гена глушить SlCESA6 (Solyc02g0722240), вторичные клеточной стенки целлюлозы синтазы, и орфогирование AtCESA8 (At4g18780). Последующие почво-заливание прививки с Ralstonia показали, что заглушая SlCESA6 повышенной устойчивостью к бактериальным симптомам увядания, предполагая, что клеточная стенка опосредованного сопротивления Ralstonia, вероятно, сохраняется в томатах, и проверки нашего метода для проведения генетического анализа бактериальной устойчивости увядания в томатных корней. Здесь мы подробно описываем этот метод, позволяющий генетическим подходам понимать бактериальное заболевание увядание за относительно короткое время и с небольшими требованиями оборудования и пространства роста растений.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ralstonia solanacearum представляет собой серьезную угрозу для сельского хозяйства; однако его взаимодействие с природными хозяевами сельскохозяйственного значения по-прежнему плохо понимается по сравнению с другими бактериальными патогенами, особенно у видов растениеводства. В большин?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим всех сотрудников лаборатории Мачо за полезные обсуждения, Альваро Лопес-Гарсия за статистические консультации и Синью Цзянь за техническую и административную помощь в ходе этой работы. Мы благодарим PSC Cell Biology основной объект за помощь в флуоресценции изображений Эта работа была поддержана Стратегической приоритетной исследовательской программы Китайской академии наук (грант XDB27040204), Шанхайский центр биологии стресса растений (китайский Академия наук) и китайская программа «1000 талантов».
Materials
| 90 mm square Petri-dishes | |||
| Agar powder | Sigma-Aldrich | ||
| Bacto peptone | BD (Becton and Dickinson) | ||
| Casamino acids | Sigma-Aldrich | ||
| Filter paper | |||
| In Vivo Plant Imaging System NightShade LB 985 | Berthold Technologies | ||
| Jiffy pots | Jiffy Products International A.S. | ||
| Micropore tape | 3M | ||
| Murashige and Skoog medium (M519) | Phytotechlab | ||
| Pindstrup substrate | Pindstrup Mosebrug A/S | ||
| Scalpel and blade | |||
| Sodium hypochlorite | Sigma-Aldrich | ||
| Sterile clean bench | |||
| Tweezers | |||
| Wahtman paper | Wahtman International Ltd. Maldstone | ||
| Yeast extract | OXOID |
Riferimenti
- Jiang, G., et al. Bacterial Wilt in China: History, Current Status, and Future Perspectives. Frontiers in Plant Science. 11 (8), 1549 (2017).
- Mansfield, J., et al. Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology. Molecular plant pathology. 13 (6), 614-629 (2012).
- Elphinstone, J. G., Allen, C., Prior, P., Hayward, A. C. . The current bacterial wilt situation: a global overview. In: Bacterial Wilt Disease and the Ralstonia solanacearum Species Complex. , 9-28 (2005).
- Jones, J. B., Jones, J. P., Stall, R. E., Zitter, T. A. . Compendium of Tomato 1094 Diseases. , (1991).
- Ho-Plágaro, T., Huertas, R., Tamayo-Navarrete, M. I., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. An improved method for Agrobacterium rhizogenes-mediated transformation of tomato suitable for the study of arbuscular mycorrhizal symbiosis. Plant Methods. 14, 34 (2018).
- Wydra, K., Beri, H. Structural changes of homogalacturonan, rhamnogalacturonan I and arabiogalactan protein in xylem cell walls of tomato gentoypes in reaction to Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 68, 41-50 (2006).
- Wydra, K., Beri, H. Immunohistochemical changes in methyl-ester distribution of homogalacturonan and side chain composition of rhamnogalacturonan I as possible components of basal resistance in tomato inoculated with Ralstonia solanacearum. Physiological and Molecular Plant Pathology. 70, 13-24 (2007).
- Hernández-Blanco, C., et al. Impairment of cellulose synthases required for Arabidopsis secondary cell wall formation enhances disease resistance. Plant Cell. 19 (3), 890-903 (2007).
- Denancé, N., et al. Arabidopsis wat1 (walls are thin1)-mediated resistance to the bacterial vascular pathogen, Ralstonia solanacearum, is accompanied by cross-regulation of salicylic acid and tryptophan metabolism. Plant Journal. 73 (2), 225-239 (2013).
- Digonnet, C., et al. Deciphering the route of Ralstonia solanacearum colonization in Arabidopsis thaliana roots during a compatible interaction: focus at the plant cell wall. Planta. 236 (5), 1419-1431 (2012).
- Sang, Y., et al. The Ralstonia solanacearum type III effector RipAY targets plant redox regulators to suppress immune responses. Molecular Plant Pathology. 19 (1), 129-142 (2018).
- Remigi, P., Anisimova, M., Guidot, A., Genin, S., Peeters, N. Functional diversification of the GALA type III effector family contributes to Ralstonia solanacearum adaptation on different plant hosts. New Phytologist. 192, 976-987 (2011).
- Wang, K., et al. Functional assignment to positively selected sites in the core type III effector RipG7 from Ralstonia solanacearum. Molecular Plant Pathology. 17, 553-564 (2016).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2-ΔΔCT method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- León-Morcillo, R. J., Martín-Rodríguez, J. A., Vierheilig, H., Ocampo, J. A., García-Garrido, J. M. Late activation of the 9-oxylipin pathway during arbuscular mycorrhiza formation in tomato and its regulation by jasmonate signalling. Journal of Experimental Botany. 63 (10), 3545-3558 (2012).
- Amrhein, V., Greenland, S., McShane, B. Retire statistical significance. Nature. 567, 305-307 (2019).
