الخلايا الليفية المستمدة 3D مصفوفة النظام المطبق علي فحص الأنابيب البطانية تشكيل
Summary
والهدف من هذا الأسلوب هو الحصول علي الخلايا الليفية المستمدة من المصفوفات 3D كسقالة طبيعيه لاختبارات الخلوية اللاحقة. يتم البذر الخلايا الليفية في لوحه الثقافة قبل المعالجة وحفز مع حمض الاسكوربيك لتوليد مصفوفة. المصفوفات هي المكررة ومسدودة للثقافة الخلايا ذات الصلة (علي سبيل المثال ، الخلايا البطانية).
Abstract
مصفوفة خارج الخلية (ECM) هي سقالة ثلاثية الابعاد التي تعمل بمثابه الدعم الرئيسي للخلايا في الانسجه. الاضافه إلى وظيفتها الهيكلية ، يشارك الECM أيضا في هجره الخلايا ، والانتشار ، والتمايز. الخلايا الليفية هي النوع الرئيسي للخلايا تعديل ترتيب ألياف ECM والإنتاج. في السرطان ، CAFs (الأورام الليفية المرتبطة بالسرطان) هي في حاله التنشيط الدائم ، والمشاركة في أعاده عرض ECM ، وتسهيل هجره الخلايا السرطانية ، وتحفيز تولد الاوعيه المرتبطة بالورم ، من بين الأدوار الأخرى الموالية للتوريجيني. والهدف من هذا الأسلوب هو إنشاء مصفوفة ثلاثية الابعاد مع تكوين ألياف التي تشبه في المصفوفات المجرية ، وذلك باستخدام الخلايا الليفية الخلد أو CAFs الاساسيه الإنسان. يتم استزراع الخلايا الليفية في لوحات ثقافة الخلية قبل المعالجة وتزرع تحت تحفيز حمض الاسكوربيك. ثم يتم أزاله الخلايا الليفية ويتم حظر المصفوفات لمزيد من البذر الخلية. في هذا النموذج ECM ، يمكن تنشيط الخلايا الليفية أو تعديلها لتوليد أنواع مختلفه من المصفوفة ، التي يمكن دراستها اثار في ثقافة الخلية. كما تتشكل المصفوفات ثلاثية الابعاد بواسطة إشارات الخلايا ، مثل التحلل أو الانزيمات المتداخلة التي قد تعدل توزيع ألياف. وفي هذا السياق ، يمكن دراسة الاوعيه الدموية ، إلى جانب أنواع الخلايا الأخرى مثل خلايا الورم الظهاريه.
Introduction
المصفوفة خارج الخلية (ECM) هي بنيه ديناميكية موجودة في جميع أنواع الانسجه. وهو يتالف من البروتينات والسكريات التي تخلق شبكه من ألياف الحاسمة للتصاق الخلية ، والهجرة ، والاتصالات1. يختلف تكوين ECM حسب الانسجه. في حين ان الكولاجين من النوع الأول هو البروتين الهيكلي الأكثر انتشارا ، يمكن أيضا العثور علي أنواع الكولاجين الثاني والثالث والخامس والحادي عشر في الانسجه المختلفة2. وهناك حاجه fibronectin التي تولدها الخلايا الليفية للتصاق الخلية2. وعلاوة علي ذلك ، هناك جزيئات هيكليه أخرى مثل والايلاستين ، laminin والمستقبلات السطحية تسمي التكاملات التي تتوسط الجمعية ألياف ومحدده لأنسجه ECM مختلفه2. يلعب ECM دورا هاما كسقالة الخلية ويمكن أيضا ان تشارك في كل من العمليات الفسيولوجية والمرضية1. لوحظت تشوات في ECM في امراض مثل السرطان ، الذي يغير تكوين ECM و/أو تنظيمها. في الأورام ، يمثل ECM المكون غير الخلوي للبيئة المجهرية للورم (TME) ، وهو بيئة معقده من مكونات الخلايا مثل الخلايا الليفية ، والخلية المناعية ، والخلايا البطانية ، والعجانات ، ومجموعه متنوعة من العوامل القابلة للذوبان. ومن المعروف ان TME يعزز تقدم السرطان والانبثاث. الخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان, كنوع الخلية المهيمنة في سدي الورم, المشاركة في هذه العملية3. علي عكس الخلايا الليفية العادية ، CAFs في التنشيط الدائم ، والتي تظهر زيادة إفراز البروتينات ECM وعوامل النمو (علي سبيل المثال ، تحويل عامل النمو-β ، TGF-β) ، فضلا عن تعبير اعلي من بعض علامات ، مثل العضلات الملساءα (α-SMA) والخلايا الليفية تنشيط البروتين ومع ذلك ، CAFs هي السكان خليه غير متجانسة ، والتي تبين مستويات مختلفه من التنشيط أو علامة التعبير5. ويمكن افتراض ذلك ان تكوين وهيكل المصفوفات المستمدة من الخلايا الليفية سوف تعتمد علي حاله الخلايا الليفية والخصائص.
وفي هذا السياق ، فان الهدف من هذه المنهجية هو إنشاء نموذج مناسب في المختبر لتوليد المحتوي بالخلايا الليفية مكافئه لوضع ECM في الجسم. نقترح هذا النهج كمنهجيه انتقاليه في المختبر لمزيد من الدراسات لوظائف الخلايا السرطانية ، مثل المقاومة الكيميائية أو الهجرة ، بوساطة ECM. كما نشرت مجموعتنا في مكان آخر ، ويمكن الحصول علي CAFs من عينات الانسجه الطازجة ، ولكن لا بد من الاشاره إلى ان البقاء علي الحياة CAFs في الثقافة محدوده ويتم تخفيض عدد الخلايا الخاصة بهم6. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام الثقافات الاساسيه CAF المنشاة من عينات المرضي لتوليد مصفوفة. التلاعب في التعبير الجيني في الخلايا الليفية هو أيضا وسيله مثيره للاهتمام لإنتاج مصفوفات متنوعة في المختبر لتقييم الآثار المحتملة علي تكوين مصفوفة, الاتجاه ألياف, الخ. وعلي هذا المنوال ، قامت مجموعتنا مؤخرا بالإبلاغ عن دور الخلايا الليفية التي تعبر عن الحلزون في تكوين واتجاه ألياف لمختلف المصفوفات المشتقة7.
وعلاوة علي ذلك ، فان CAFs ونظام ECM يشاركان في الجهاز الوعائي ، سواء في توليد السفن أو كجزء من الطبقة الخارجية لإناء الزهر8. أعاده عرض ECM يحفز تولد الاوعيه. مصفوفة المعادن الفلزية (mmps) ويبدو ان نوع الانزيم الأكثر اهميه المساهمة في هذه العملية9,10. الاوعيه الدموية الانسجه من الخلايا الاوليه التي تولد ECMs ، الجزيئات ECM ، وعوامل النمو المتبقية المدرجة في ECM ، ومرونة مصفوفة ، وسمك مصفوفة توصف بأنها العوامل التي تنطوي علي تنشيط الخلايا البطانية11. في الأورام ، ونقص الأكسجين يزيد من صلابة ECM والبطانية برعم الجيل12. وعلاوة علي ذلك, CAFs تفرز عامل نمو بطانة الاوعيه الدموية (VEGF) وعامل النمو المشتق من الصفائح الدموية (PDGF) التي تحفز تولد الاوعيه في الورم سدي13. في هذا المجال ، يمكن استخدام توليد مصفوفة في المختبر لدراسة عمليات تولد الاوعيه أو العمل التناسبي المختلط في ظل ظروف تجريبية مختلفه. التالي ، يمكن ان يكون الاستنساخ في المختبر من المصفوفة الأكثر تشابها في الجسم المجري أداه قيمه للتحقيق في دور ECM في الاوعيه الدموية أو التفاعلات الخلية البيئية الصغرى.
تحفيز الخلايا الليفية مثقف مع حمض الاسكوربيك لتعزيز ترسب مصفوفة وتوليد ECM هو وسيله مقبوله لإنتاج مماثله في المصفوفات المجرية. يتم استزراع خطوط الخلايا الليفية الخلد بسهوله ويتم تنشيطها من قبل عوامل النمو المتنوعة ، مثل PDGF-BB ، عامل نخر الورم-α (TNF-α) أو TGF-β14. داخل tme, cafs توليف الكولاجين من النوع الأول و الفيبرونكتين جنيني كمكونات رئيسيه من ECM4. المثل ، تم العثور علي هذه المكونات كمكونات رئيسيه لمصفوفات مشتقه من الخلايا الليفية المتولدة في المختبر (الشكل 1).
وهناك منهجيات مختلفه في المختبر لمحاكاة في الجسم العام ECM. تم تمديد استخدام الاطباق الثقافة المغلفة مع خليط من ألياف ECM في السنوات الماضية ، ولكن هذا النهج 2D بحاجه إلى تحسين الهياكل 3D ، مثل الهلام المرتبطة (علي سبيل المثال ، الحاكم)1. أصبح الاعداد الشبيه بالقاعدة الطريقة القياسية لمحاكاة مصفوفة ثلاثية الابعاد. ويعد الليفيبين أيضا بديلا عند توليد المصفوفات ولكنه يفشل من حيث قوه ومتانة المحتوي1. الكولاجين المستخدم بالاشتراك مع مكونات ECM الأخرى يعدل بعض القضايا المذكورة أعلاه. ومع ذلك ، فان هذه الهلام الكولاجين تشكل شبكه قويه مع ألياف التي يمكن ان تكون موجهه ، ولكنها غير متجانسة للغاية ، والتي يمكن ان تكون مشكله في التكرار التجربة1. ومع ذلك ، يجب ان نفترض انه ، اعتمادا علي الهدف من التجارب ، واستخدام المصفوفات أو غيرها من الهلام المائي هو أكثر ملاءمة (علي سبيل المثال ، في دراسات انكماش مصفوفة التي يمكن الكشف عن تقلص هلام بسهوله).
يمكن ان تكون الوالاستمناع المحتملة للمصفوفات التي تم إنشاؤها مشكله في التجارب مع بعض أنواع الخلايا. ولذلك ، للحد من امكانيه الاستجابات المناعية بسبب خلايا توليد ECM عند استخدام طريقتنا ، والمصفوفات وغسلها ، وعلي الرغم من ان أزاله جزء الخلية لا يمكن ان يكون المجموع15. يحتاج ECM المثالي إلى ان يكون متوافقا مع ثقافة الخلايا وقادرا علي التواصل والتفاعل مع إشارات الخلايا. إجراءاتنا تسمح بإدخال التغييرات دون صعوبة اثناء إنتاج ECM (علي سبيل المثال ، أضافه عوامل النمو تحفيز الخلايا الليفية).
Protocol
Representative Results
Discussion
يمكن ان تتولد المصفوفات مع الخلايا الليفية الخلد أو ثقافات الخلايا الليفية الاوليه. الخلايا الليفية من السهل الحفاظ عليها في الزراعة في المختبر مع معدل نمو عال ومقاومه الإجهاد. حتى انها يمكن ان تكون معزولة عن الانسجه بعد الوفاة3، علي الرغم من ان التلوث يمكن ان يكون قيدا ، اعتم…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد تطوير هذا البروتوكول PI12/02037 و PI15/02101 و PI17/01847 و PI18/01034 و RD12/0036/0041 من معهد الصليب كارلوس الثالث ؛ الاتحاد الأوروبي للتنمية الاقليميه (FEDER) ؛ بواسطة “CIBER de Cáncer” ، CB16/12/00273 و CB16/12/00446 ، من معهد الصليب كارلوس الثالث-FEDER ؛ ومن قبل مؤسسه Científica AECC (نهج متعدد الأوجه لاستهداف سرطان البنكرياس). وقد تلقت كريستينا بينيا عقد ميغيل سيرفيت من معهد الصليب كارلوس الثالث. ساعد m. Eaude مع النص الإنكليزي. نشكر أعضاء المختبر للحصول علي المساعدة والمشورة في جميع انحاء هذا البحث.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
