Fibroblast-afgeleid 3D-matrix systeem dat van toepassing is op endotheliale buis vorming assay
Summary
Het doel van deze methode is om fibroblast-afgeleide 3D-matrices te verkrijgen als een natuurlijke steiger voor volgende cellulaire assays. Fibroblasten worden in een voorbehandelde kweek plaat geseeid en gestimuleerd met ascorbinezuur voor matrix generatie. Matrices zijn decellularized en geblokkeerd voor de kweek van relevante cellen (bijv. endotheel cellen).
Abstract
De extracellulaire matrix (ECM) is een driedimensionale steiger die fungeert als de belangrijkste ondersteuning voor cellen in weefsels. Naast zijn structurele functie neemt de ECM ook deel aan Celmigratie, proliferatie en differentiatie. Fibroblasten zijn het belangrijkste type cellen die de ECM-vezel regeling en-productie wijzigen. Bij kanker, CAFs (kanker geassocieerde fibroblasten) zijn in permanente activeringsstatus, deelnemen aan ECM-remodeling, faciliteren van tumor Celmigratie, en het stimuleren van tumor-geassocieerde angiogenese, onder andere Pro-tumorigenic rollen. Het doel van deze methode is het creëren van een driedimensionale matrix met een vezelsamenstelling die vergelijkbaar is met in vivo matrices, met behulp van vereeuwigd fibroblasten of menselijke primaire CAFs. Fibroblasten worden gekweekt in voorbehandelde celkweek platen en geteeld onder ascorbinezuur stimulatie. Vervolgens worden fibroblasten verwijderd en worden matrices geblokkeerd voor verdere celseeding. In dit ECM-model kunnen fibroblasten worden geactiveerd of aangepast om verschillende soorten matrix te genereren, waarvan de effecten in de celkweek kunnen worden bestudeerd. 3D-matrices worden ook gevormd door celsignalen, zoals degradatie of kruislings verbindende enzymen die de vezel verdeling kunnen wijzigen. In deze context, angiogenese kan worden bestudeerd, samen met andere celtypen zoals epitheliale tumorcellen.
Introduction
De extracellulaire matrix (ECM) is een dynamische structuur die aanwezig is in alle soorten weefsels. Het bestaat uit eiwitten en polysacchariden die een netto van vezels van cruciaal belang voor celadhesie, migratie en communicatie1creëren. De samenstelling van ECM varieert afhankelijk van het weefsel. Hoewel type-I collageen het meest voorkomende structurele eiwit is, kunnen collageen typen II, III, V en XI ook worden gevonden in verschillende weefsels2. Fibronectine gegenereerd door fibroblasten is nodig voor celadhesie2. Bovendien zijn er andere structurele moleculen zoals elastine, laminine en oppervlakte receptoren genaamd integrinen die vezel assemblage bemiddel en specifiek zijn voor de verschillende ECM-weefsels2. De ECM speelt een belangrijke rol als een celsteiger en kan ook betrokken zijn bij zowel fysiologische als pathologische processen1. Afwijkingen in de ECM worden waargenomen bij pathologieën zoals kanker, wat de ECM-samenstelling en/of de organisatie verandert. In tumoren vertegenwoordigt de ECM de niet-cellulaire component van de tumor micro Environment (TME), een complex milieu van celcomponenten zoals fibroblasten, immuuncellen, endotheel cellen, pericytes en een verscheidenheid aan oplosbare factoren. Het is bekend dat de TME bevordert kanker progressie en metastase; kanker-geassocieerde fibroblasten, als een overheersende celtype in de tumor stroma, neem deel aan dit proces3. In tegenstelling tot normale fibroblasten, zijn CAFs in permanente activering, met een verhoogde secretie van ECM-eiwitten en groeifactoren (bijv. transformerende groei factor-β, TGF-β), evenals een hogere uitdrukking van sommige markers, zoals α-gladde spier actine (α-SMA) en fibroblast activerings proteïne (FAP)4. CAFs zijn echter een heterogene celpopulatie, die verschillende niveaus van activering of marker expressie5weergeeft. Er kan worden aangenomen dat de samenstelling en structuur van fibroblast-afgeleide matrices afhankelijk zijn van fibroblast-status en kenmerken.
In deze context is het doel van deze methodologie om een geschikt in vitro model te creëren voor de opwekking van ECM door fibroblasten, equivalent met de in vivo ECM-instelling. Wij stellen deze aanpak voor als een in vitro translationele methodologie voor verdere studies van tumor celfuncties, zoals chemoresistance of migratie, gemedieerd door ECM. Zoals onze groep elders heeft gepubliceerd, kunnen CAFs worden verkregen uit verse weefselmonsters, maar er moet worden opgemerkt dat het voortbestaan van de CAFs in cultuur beperkt is en dat het nummer van de celpassage wordt verlaagd6. Bovendien, CAF primaire culturen die zijn vastgesteld uit de monsters van patiënten kunnen worden gebruikt voor matrix generatie. Manipulatie van genexpressie in fibroblasten is ook een interessante manier om gevarieerde in vitro matrices te produceren om de mogelijke effecten op de matrix samenstelling, Fiber oriëntatie, etc. te beoordelen. Langs deze lijnen heeft onze groep onlangs de rol van de slak-uitdrukken fibroblasten in de samenstelling en Fiber oriëntatie van verschillende afgeleide matrices7gerapporteerd.
Bovendien zijn CAFs en ECM betrokken bij het vasculaire systeem, zowel bij het genereren van schepen als als onderdeel van de buitenste laag van de vaas8. ECM-remodellering induceert angiogenese; matrix matrixmetalloproteïnases (mmps) lijken het belangrijkste enzym type te zijn dat bijdraagt aan dit proces9,10. De weefsel vascularisatie van primaire cellen die de ECMs genereren, ECM-macromoleculen, residuele groeifactoren opgenomen in de ECM, matrix elasticiteit en matrix dikte worden beschreven als factoren die betrokken zijn bij de activering van endotheliale cellen11. In tumoren, hypoxie verhoogt ECM stijfheid en endotheliale Sprout generatie12. Bovendien, CAFs afscheiden vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) en bloedplaatjes-afgeleide groeifactor (PDGF) die angiogenese in tumor stroma13stimuleren. Op dit gebied, in vitro matrix generatie kan worden gebruikt voor het bestuderen van angiogenese processen of MMP actie onder verschillende experimentele omstandigheden. Zo kan de in vitro reproductie van de meest analoge in vivo matrix een waardevol instrument zijn om de rol van ECM bij de interacties van angiogenese of micro-omgevings cellen te onderzoeken.
Het stimuleren van gekweekte fibroblasten met ascorbinezuur om de matrix depositie te verbeteren en een ECM te genereren, is een geaccepteerde manier om analoge in vivo matrices te produceren. Vereeuwigd fibroblast cellijnen zijn gemakkelijk gekweekt en worden geactiveerd door verschillende groeifactoren, zoals PDGF-BB, tumor necrose factor-α (TNF-α) of TGF-β14. Binnen de TME, CAFs synthetiseren type-I collageen en fibronectin als de belangrijkste componenten van ECM4. Evenzo worden deze componenten gevonden als belangrijke componenten van in vitro gegenereerde, met fibroblast afgeleide matrices (Figuur 1).
Er zijn verschillende in vitro methodieken om in vivo ECM te simuleren. Het gebruik van gecoate kweek gerechten met mengsels van ECM-vezels werd in de afgelopen jaren verlengd, maar deze 2D-aanpak had een verbetering nodig van 3D-structuren, zoals cross-linked gels (bijv. Matrigel)1. De Matrigel-achtige Setup is uitgegroeid tot de standaardmethode voor het simuleren van een 3D-matrix. Fibrin is ook een alternatief bij het genereren van matrices, maar faalt in termen van sterkte en duurzaamheid van de ECM1. Collageen dat in combinatie met andere ECM-componenten wordt gebruikt, wijzigt enkele van de bovengenoemde problemen. Deze collageen gels vormen echter een sterk netwerk met vezels die kunnen worden georiënteerd, maar zijn zeer heterogeen, wat een probleem kan zijn in experiment herhalingen1. Niettemin moet ervan worden uitgegaan dat, afhankelijk van het doel van de experimenten, het gebruik van Matrigel of andere hydrogels geschikter is (bijvoorbeeld in matrix contractie studies waarbij de samentrekking van de gel gemakkelijk kan worden opgespoord).
De potentiële immunogeniciteit van de gegenereerde matrices kan een probleem zijn in experimenten met sommige celtypen. Daarom, om de mogelijkheid van immuunresponsen als gevolg van ECM-genererende cellen bij het gebruik van onze methode te verminderen, zijn matrices decellularized en gewassen, hoewel het verwijderen van celfragment niet in totaal15kon zijn. De ideale ECM moet compatibel zijn met de celcultuur en kan communiceren en reageren op celsignalen. Onze procedure maakt het mogelijk om zonder problemen veranderingen aan te brengen tijdens de productie van ECM (bijv. het toevoegen van fibroblast-stimulerende groeifactoren).
Protocol
Representative Results
Discussion
Matrices kunnen worden gegenereerd met vereeuwigd fibroblasten of primaire fibroblast-culturen. Fibroblasten zijn gemakkelijk te onderhouden in in vitro cultuur met een hoge groeisnelheid en stressbestendigheid. Ze kunnen zelfs worden geïsoleerd van postmortemweefsel3, hoewel verontreiniging een beperking kan zijn, afhankelijk van de weefsel oorsprong.
Het 3D-matrixmodel biedt hier een nieuw en effectief systeem om de ECM-compositie en vezel oriëntatie succesvol te be…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De ontwikkeling van dit protocol werd gesteund door PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 en RD12/0036/0041 van het Instituto de Salud Carlos III; door de regionale Fondo Europeo de Desarrollo (FEDER); door “CIBER de cáncer”, CB16/12/00273 en CB16/12/00446, van het Instituto de Salud Carlos III-FEDER; en door de Fundación científica aecc (een veelzijdige aanpak om alvleesklierkanker te richten). Cristina Peña is een ontvanger van een Miguel servet contract van het Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude hielp met de Engelse tekst. We danken lableden voor hulp en advies tijdens dit onderzoek.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
Riferimenti
- Frantz, C., Stewart, K. M., Weaver, V. M. The extracellular matrix at a glance. Journal of Cell Science. 123 (24), 4195-4200 (2010).
- Kular, J. K., Basu, S., Sharma, R. I. The extracellular matrix: Structure, composition, age-related differences, tools for analysis and applications for tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 5, (2014).
- Kalluri, R. The biology and function of fibroblasts in cancer. Nature Reviews Cancer. 16 (9), 582-598 (2016).
- Erdogan, B., Webb, D. J. Cancer-associated fibroblasts modulate growth factor signaling and extracellular matrix remodeling to regulate tumor metastasis. Biochemical Society Transactions. 45 (1), 229-236 (2017).
- Erez, N., Truitt, M., Olson, P., Hanahan, D. Cancer-Associated Fibroblasts Are Activated in Incipient Neoplasia to Orchestrate Tumor-Promoting Inflammation in an NF-kB-Dependent Manner. Cancer Cell. 17 (2), 135-147 (2010).
- Herrera, M., et al. Colon Cancer-associated Fibroblast Establishment and Culture Growth. Bio-protocol. 6 (7), e1773 (2016).
- Herrera, A., et al. Endothelial cell activation on 3D-matrices derived from PDGF-BB-stimulated fibroblasts is mediated by Snail1. Oncogenesis. 7 (9), 76 (2018).
- MacColl, E., Khalil, R. A. Matrix Metalloproteinases as Regulators of Vein Structure and Function: Implications in Chronic Venous Disease. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 355 (3), 410-428 (2015).
- Shian, S. G., Kao, Y. R., Wu, F. Y. H., Wu, C. W. Inhibition of Invasion and Angiogenesis by Zinc-Chelating Agent Disulfiram. Molecular Pharmacology. 64 (5), 1076-1084 (2003).
- Neri, S., et al. Cancer cell invasion driven by extracellular matrix remodeling is dependent on the properties of cancer-associated fibroblasts. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 142 (2), 437-446 (2016).
- Du, P., Subbiah, R., Park, J. H., Park, K. Vascular morphogenesis of human umbilical vein endothelial cells on cell-derived macromolecular matrix microenvironment. Tissue Engineering. (Part A), (2014).
- Bignon, M., et al. Lysyl oxidase-like protein 2 regulates sprouting angiogenesis and type IV collagen assembly in the endothelial basement membrane. Blood. 118 (14), 3979-3989 (2011).
- Huang, L., Xu, A. M., Liu, S., Liu, W., Li, T. J. Cancer-associated fibroblasts in digestive tumors. World Journal of Gastroenterology. 20 (47), 17804-17818 (2014).
- Herrera, A., Herrera, M., Peña, C. The emerging role of Snail1 in the tumor stroma. Clinical and Translational Oncology. 18 (9), 872-877 (2016).
- Sheng, Y., Fei, D., Leiiei, G., Xiaosong, G. Extracellular Matrix Scaffolds for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Current Stem Cell Research & Therapy. 12 (3), 233-246 (2017).
- Castelló-Cros, R., Cukierman, E. Stromagenesis during tumorigenesis: characterization of tumor-associated fibroblasts and stroma-derived 3D matrices. Methods in Molecular Biology. 522, 275-305 (2009).
