Sistema de matriz 3D derivado do fibroblasto aplicável ao ensaio de formação do tubo endotelial
Summary
O objetivo deste método é obter matrizes 3D derivadas de fibroblasto como um andaime natural para ensaios celulares subsequentes. Os fibroblastos são semeados em uma placa de cultura pré-tratada e estimulados com ácido ascórbico para geração de matriz. As matrizes são descelularizadas e bloqueadas para a cultura de células relevantes (por exemplo, células endotélias).
Abstract
A matriz extracelular (ECM) é um andaime tridimensional que atua como o principal suporte para as células nos tecidos. Além de sua função estrutural, o ECM também participa da migração celular, proliferação e diferenciação. Fibroblastos são o principal tipo de células modificando o arranjo de fibra e a produção de ECM. No câncer, os CAFs (fibroblastos associados ao câncer) estão em estado de ativação permanente, participando da remodelação do ECM, facilitando a migração de células tumorais e estimulando a angiogênese associada ao tumor, entre outros papéis pró-tumorigenic. O objetivo deste método é criar uma matriz tridimensional com uma composição de fibra semelhante às matrizes in vivo, utilizando fibroblastos imortalizados ou CAFs primários humanos. Os fibroblastos são cultivados em placas de cultura celular pré-tratadas e cultivados estimulação de ácido ascórbico. Em seguida, os fibroblastos são removidos e matrizes são bloqueadas para semeadura celular. Neste modelo De ECM, os fibroblastos podem ser ativados ou modificados para gerar diferentes tipos de matriz, cujos efeitos podem ser estudados na cultura celular. As matrizes 3D também são moldadas por sinais celulares, como degradação ou enzimas que ligam cruzadas que podem modificar a distribuição de fibras. Neste contexto, a angiogênese pode ser estudada, juntamente com outros tipos de células, como células tumorais epiteliais.
Introduction
A matriz extracelular (ECM) é uma estrutura dinâmica presente em todos os tipos de tecido. Consiste em proteínas e polissacarídeos que criam uma rede de fibras cruciais para a adesão celular, migração e comunicação1. A composição de ECM varia dependendo do tecido. Enquanto o colágeno tipo-I é a proteína estrutural mais prevalente, os tipos de colágeno II, III, V e XI também podem ser encontrados em vários tecidos2. Fibronectina gerada por fibroblastos é necessária para a adesão celular2. Além disso, existem outras moléculas estruturais como elastina, laminina e receptores de superfície chamados integrinas que mediam a montagem de fibras e são específicas para os diferentes tecidosECM 2. O ECM desempenha um papel importante como andaime celular e também pode estar envolvido em processos fisiológicos e patológicos1. As anormalidades no ECM são observadas em patologias como câncer, que altera a composição do ECM e/ou sua organização. Em tumores, o ECM representa o componente não celular do microambiente tumoral (TME), um ambiente complexo de componentes celulares, como fibroblastos, células imunes, células endotélias, pericitos e uma variedade de fatores solúveis. Sabe-se que a TME promove a progressão do câncer e a metástase; fibroblastos associados ao câncer, como um tipo de célula predominante no estroma tumoral, participam desse processo3. Ao contrário dos fibroblastos normais, os CAFs estão em ativação permanente, mostrando maior secreção de proteínas ecm e fatores de crescimento (por exemplo, Transformando fator de crescimento-β, TGF-β), bem como uma maior expressão de alguns marcadores, como a actina muscular α-smooth (α-SMA) e proteína de ativação de fibroblasto (FAP)4. No entanto, os CAFs são uma população heterogênea de células, mostrando diferentes níveis de ativação ou expressãomarcador5. Pode-se supor então que a composição e a estrutura de matrizes fibroblasto-derivadas dependerão do status e das características do fibroblasto.
Neste contexto, o objetivo desta metodologia é estabelecer um modelo in vitro adequado para a geração de ECM por fibroblastos equivalentes à configuração in vivo de ECM. Propomos essa abordagem como uma metodologia translacional in vitro para estudos posteriores de funções de células tumorais, como quimioresistência ou migração, mediada pela ECM. Como o nosso grupo publicou em outros lugares, CAFs podem ser obtidos a partir de amostras de tecido fresco, mas tem que ser notado que a sobrevivência dos CAFs na cultura é limitada e seu número de passagem celular é reduzido6. Além disso, as culturas primárias da CAF estabelecidas a partir de amostras de pacientes podem ser usadas para geração de matriz. A manipulação da expressão gênica em fibroblastos também é uma maneira interessante de produzir matrizes in vitro variadas para avaliar os possíveis efeitos na composição da matriz, orientação de fibras, etc. Ao longo destas linhas, nosso grupo relatou recentemente o papel de fibroblastos de expressar caracol na composição e orientação de fibras de várias matrizes derivadas7.
Além disso, cafs e ECM estão envolvidos no sistema vascular, tanto na geração de navios e como parte do vaso camada externa8. A remodelação do ECM induz a angiogênese; metaloproteinases matriz (MMPs) parecem ser o tipo de enzima mais importante contribuindo para este processo9,10. A vascularização tecidual de células primárias que geram os ECMs, macromoléculas de ECM, fatores de crescimento residuais incluídos no ECM, elasticidade da matriz e espessura da matriz são descritos como fatores envolvidos na ativação de células endotélias11. Em tumores, hipóxia aumenta a rigidez do ECM e a geração de brotos endotelianos12. Além disso, os CAFs secretam o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) que estimulam a angiogênese no estroma13do tumor. Neste campo, a geração de matriz in vitro poderia ser usada para estudar processos de angiogênese ou ação de MMP diferentes condições experimentais. Assim, a reprodução in vitro da matriz in vivo mais análoga pode ser uma ferramenta valiosa para investigar o papel da ECM na angiogênese ou nas interações microambientais celulares.
A estimulação de fibroblastos cultivados com ácido ascórbico para melhorar a deposição da matriz e gerar um ECM é uma maneira aceita de produzir matrizes in vivo análogas. As linhas de células fibroblastas imortalizadas são facilmente cultivadas e ativadas por diversos fatores de crescimento, como PDGF-BB, Tumor Necrosis Factor-α (TNF-α) ou TGF-β14. Dentro da TME, cafs sintetizar tipo-I colágeno e fibronectina como os principais componentes da ECM4. Da mesma forma, esses componentes são encontrados como componentes principais de matrizes derivadas de fibroblasto in vitro (Figura 1).
Existem diferentes metodologias in vitro para simular in vivo ECM. O uso de pratos de cultura revestido com misturas de fibras ECM foi estendido nos últimos anos, mas essa abordagem 2D precisava de melhorias nas estruturas 3D, como géis interligados (por exemplo, Matrigel)1. A configuração matrigel-like tornou-se o método padrão para simular uma matriz 3D. Fibrin também é uma alternativa ao gerar matrizes, mas falha em termos de força e durabilidade do ECM1. O colágeno usado em combinação com outros componentes da ECM altera alguns dos problemas acima mencionados. No entanto, estes géis de colágeno formam uma forte rede com fibras que podem ser orientadas, mas são altamente heterogêneas, o que pode ser um problema nas repetições de experimentos1. No entanto, deve-se supor que, dependendo do objetivo dos experimentos, o uso de Matrigel ou outros hidrogéis é mais apropriado (por exemplo, em estudos de contração de matriz em que a contração do gel pode ser facilmente detectada).
A imunogenicidade potencial das matrizes geradas pode ser um problema em experimentos com alguns tipos de células. Portanto, para reduzir a possibilidade de respostas imunes devido às células geradoras de ECM ao usar nosso método, as matrizes são descelularizadas e lavadas, embora a remoção de fragmentos celulares não possa ser de15. O ECM ideal precisa ser compatível com a cultura celular e capaz de se comunicar e reagir aos sinais celulares. Nosso procedimento permite a introdução de mudanças sem dificuldade durante a produção de ECM (por exemplo, adicionando fatores de crescimento estimulantes do fibroblasto).
Protocol
Representative Results
Discussion
Matrizes podem ser geradas com fibroblastos imortalizados ou culturas fibroblastprimárias. Fibroblastos são fáceis de manter na cultura in vitro com uma alta taxa de crescimento e resistência ao estresse. Podem mesmo ser isolados do tecido post-mortem3,embora a contaminação poderia ser uma limitação, dependendo da origem do tecido.
O modelo 3D-matrix aqui oferece um sistema novo e eficaz para estudar com sucesso a composição e a orientação da fibra de ECM. T…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O desenvolvimento deste protocolo contou com o apoio do PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 e RD12/0036/0041 do Instituto de Salud Carlos III; pelo Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); por “CIBER de Cáncer”, CB16/12/00273 e CB16/12/00446, do Instituto de Salud Carlos III-FEDER; e pela Fundación Científica AECC (uma abordagem multifacetada para atingir o câncer de pâncreas). Cristina Peña é beneficiária de um Contrato Miguel Servet do Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude ajudou com o texto em inglês. Agradecemos aos membros do laboratório por ajuda e conselhos ao longo desta pesquisa.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
Riferimenti
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