Sistema de matriz 3D derivado de fibroblastos aplicable al ensayo de formación de tubos endoteliales
Summary
El objetivo de este método es obtener matrices 3D derivadas de fibroblastos como un andamio natural para ensayos celulares posteriores. Los fibroblastos se sembran en una placa de cultivo pretratada y se estimulan con ácido ascórbico para la generación de matrices. Las matrices se descelularizan y se bloquean para cultivar células relevantes (por ejemplo, células endoteliales).
Abstract
La matriz extracelular (ECM) es un andamio tridimensional que actúa como el principal soporte para las células en los tejidos. Además de su función estructural, el ECM también participa en la migración celular, la proliferación y la diferenciación. Los fibroblastos son el principal tipo de células que modifican la disposición y producción de fibra ECM. En el cáncer, los CAC (fibroblastos asociados al cáncer) están en estado de activación permanente, participando en la remodelación de ECM, facilitando la migración de células tumorales y estimulando la angiogénesis asociada a tumores, entre otros roles protumoraligénicos. El objetivo de este método es crear una matriz tridimensional con una composición de fibra similar a las matrices in vivo, utilizando fibroblastos inmortalizados o CAC primarios humanos. Los fibroblastos se cultivan en placas de cultivo celular pretratadas y se cultivan bajo estimulación de ácido ascórbico. Luego, se eliminan los fibroblastos y las matrices se bloquean para una mayor sembración celular. En este modelo ECM, los fibroblastos se pueden activar o modificar para generar diferentes tipos de matriz, cuyos efectos se pueden estudiar en el cultivo celular. Las matrices 3D también están formadas por señales celulares, como la degradación o enzimas reticuladas que podrían modificar la distribución de fibra. En este contexto, se puede estudiar la angiogénesis, junto con otros tipos de células como las células tumorales epiteliales.
Introduction
La matriz extracelular (ECM) es una estructura dinámica presente en todos los tipos de tejido. Consiste en proteínas y polisacáridos que crean una red de fibras cruciales para la adhesión celular, migración y comunicación1. La composición de ECM varía dependiendo del tejido. Mientras que el colágeno tipo I es la proteína estructural más prevalente, los tipos de colágeno II, III, V y XI también se pueden encontrar en varios tejidos2. La fibronectina generada por los fibroblastos es necesaria para la adhesión celular2. Además, hay otras moléculas estructurales como los receptores de elastina, laminina y superficie llamados integrinas que median el ensamblaje de fibra y son específicas de los diferentes tejidos ECM2. El ECM desempeña un papel importante como andamio celular y también puede participar en procesos fisiológicos y patológicos1. Las anomalías en el ECM se observan en patologías como el cáncer, que altera la composición del ECM y/o su organización. En los tumores, el ECM representa el componente no celular del microambiente tumoral (TME), un entorno complejo de componentes celulares como fibroblastos, células inmunitarias, células endoteliales, pericitas y una variedad de factores solubles. Se sabe que el TME promueve la progresión del cáncer y la metástasis; los fibroblastos asociados al cáncer, como tipo de célula predominante en el estroma tumoral, participan en este proceso3. A diferencia de los fibroblastos normales, los HCA están en activación permanente, mostrando una mayor secreción de proteínas ECM y factores de crecimiento (por ejemplo, Transformación del Factor de Crecimiento, TGF-, o), así como una expresión más alta de algunos marcadores, como la actina muscular lisa (-SMA) y la proteína de activación de fibroblastos (FAP)4. Sin embargo, los CAC son una población de células heterogéneas, que muestra diferentes niveles de activación o expresión de marcador5. Se puede suponer entonces que la composición y la estructura de las matrices derivadas de fibroblastos dependerádel del estado y las características de los fibroblastos.
En este contexto, el objetivo de esta metodología es establecer un modelo in vitro adecuado para la generación de ECM por fibroblastos equivalentes al entorno in vivo de ECM. Proponemos este enfoque como una metodología traslacional in vitro para estudios posteriores de las funciones de las células tumorales, como la quimiorresistencia o la migración, mediada por ECM. Como nuestro grupo ha publicado en otros lugares, los CAC se pueden obtener a partir de muestras de tejido fresco, pero hay que tener en cuenta que la supervivencia de los CAC en el cultivo es limitada y su número de paso celular se reduce6. Además, los cultivos primarios caf a partir de las muestras de los pacientes se pueden utilizar para la generación de matrices. La manipulación de la expresión génica en fibroblastos es también una forma interesante de producir matrices in vitro variadas para evaluar los posibles efectos en la composición de la matriz, la orientación de la fibra, etc. En esta línea, nuestro grupo ha informado recientemente del papel de los fibroblastos que expresan caracoles en la composición y orientación de fibra de varias matrices derivadas7.
Además, los COF y los ECM participan en el sistema vascular, tanto en la generación de vasos como como parte de la capa exterior del jarrón8. La remodelación de ECM induce angiogénesis; matriz metaloproteinasas (MMP) parecen ser el tipo de enzima más importante que contribuye a este proceso9,10. La vascularización tisular de las células primarias que generan los ECM, las macromoléculas ECM, los factores de crecimiento residuales incluidos en el ECM, la elasticidad de la matriz y el grosor de la matriz se describen como factores implicados en la activación de células endoteliales11. En los tumores, la hipoxia aumenta la rigidez de la ECM y la generación de brotes endoteliales12. Por otra parte, los CAF secretan factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) y factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) que estimulan la angiogénesis en la estromacomercial tumoral13. En este campo, la generación de matriz in vitro podría utilizarse para estudiar los procesos de angiogénesis o la acción de MMP en diferentes condiciones experimentales. Por lo tanto, la reproducción in vitro de la matriz in vivo más análoga podría ser una herramienta valiosa para investigar el papel de la ECM en la angiogénesis o las interacciones celulares microambientales.
La estimulación de fibroblastos cultivados con ácido ascórbico para mejorar la deposición de la matriz y generar un ECM es una forma aceptada de producir matrices in vivo análogas. Las líneas celulares de fibroblastos inmortalizadas se cultivan fácilmente y se activan por diversos factores de crecimiento, como PDGF-BB, Factor de necrosis tumoral (TNF– ) oTGF-14. Dentro del TME, los CAC sintetizan colágeno tipo I y fibronectina como los principales componentes de ECM4. Del mismo modo, estos componentes se encuentran como componentes principales de matrices derivadas de fibroblastos generadas in vitro(Figura 1).
Existen diferentes metodologías in vitro para simular ECM in vivo. El uso de platos de cultivo recubiertos con mezclas de fibras ECM se amplió en los últimos años, pero este enfoque 2D necesitaba mejorar las estructuras 3D, como los geles reticulados (por ejemplo, Matrigel)1. La configuración similar a Matrigel se ha convertido en el método estándar para simular una matriz 3D. La fibrina también es una alternativa a la hora de generar matrices, pero falla en términos de resistencia y durabilidad del ECM1. El colágeno utilizado en combinación con otros componentes de ECM modifica algunos de los problemas antes mencionados. Sin embargo, estos geles de colágeno forman una red fuerte con fibras que pueden ser orientadas, pero son altamente heterogéneas, lo que puede ser un problema en las repeticiones de experimentos1. No obstante, debe presumirse que, dependiendo del objetivo de los experimentos, el uso de Matrigel u otros hidrogeles es más adecuado (por ejemplo, en estudios de contracción de matrices en los que se puede detectar fácilmente la contracción del gel).
La inmunogenicidad potencial de las matrices generadas podría ser un problema en experimentos con algunos tipos de células. Por lo tanto, para reducir la posibilidad de respuestas inmunitarias debido a las células generadoras de ECM al utilizar nuestro método, las matrices se descelularizan y se lavan, aunque la eliminación de fragmentos de células no podría ser total15. El ECM ideal debe ser compatible con el cultivo celular y ser capaz de comunicarse y reaccionar a las señales celulares. Nuestro procedimiento permite la introducción de cambios sin dificultad durante la producción de ECM (por ejemplo, la adición de factores de crecimiento estimulantes de fibroblastos).
Protocol
Representative Results
Discussion
Las matrices se pueden generar con fibroblastos inmortalizados o cultivos primarios de fibroblastos. Los fibroblastos son fáciles de mantener en cultivo in vitro con una alta tasa de crecimiento y resistencia al estrés. Incluso se pueden aislar del tejido post mortem3,aunque la contaminación podría ser una restricción, dependiendo del origen del tejido.
El modelo de matriz 3D aquí ofrece un sistema novedoso y eficaz para estudiar con éxito la composición de ECM …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El desarrollo de este protocolo fue apoyado por PI12/02037, PI15/02101, PI17/01847, PI18/01034 y RD12/0036/0041 del Instituto de Salud Carlos III; por el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (FEDER); por “CIBER Cáncer de Cáncer”, CB16/12/00273 y CB16/12/00446, del Instituto de Salud Carlos III-FEDER; y por la Fundación Científica AECC (un enfoque multifacético para el cáncer de páncreas dirigido). Cristina Peña es beneficiaria de un Contrato Miguel Servet del Instituto de Salud Carlos III. M. Eaude ayudó con el texto en inglés. Agradecemos a los miembros del laboratorio por su ayuda y asesoramiento a lo largo de esta investigación.
Materials
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Roth | A990.1 | |
| Amphotericin-B | Corning | 30-003-CF | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7906-50G | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Corning | 10-014-CVR | |
| Endothelial Basal Medium (EBM) | Lonza | CC-3121 | add supplements before use |
| Endothelial cell Basal Medium Supplements (EGM-2) | Lonza | CC-4176 | |
| Ethanolamine | Sigma | 411000-100ML | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | heat-inactivated before use |
| Fibroblast Growth Basal Medium (FBM) | Lonza | CC-3131 | add supplements before use |
| Fibroblast Growth Medium Supplements and Growth Factors (FGM-2) | Lonza | CC-4126 | |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391-100G | |
| Glutaraldehyde | Sigma | g5882 | |
| L-Ascorbic Acid | Sigma | A92902-100G | light sensitive |
| L-Glutamine | Lonza | BE17-605E | |
| Normocin | Invivogen | 3ANT-NR-2 | |
| Pencillin/Streptomycin (Pen/Strep) | Gibco | 15140122 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Corning | 21-040-CVR | |
| Triton X100 | Roth | 3051 | |
| Recombinant telomerase transfected immortalized human foreskin fibroblasts (BJ-hTERT) | ATCC | ATCC CRL-4001 | |
| Human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) | ATCC | PCS-100-013 |
Riferimenti
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