Detta protokoll avbildar både den immunologiska synapsebildningen och den efterföljande polariserade sekretoriska trafiken mot den immunologiska synapsen. Cellulära konjugat bildades mellan en superantigen-pulsad Raji cell (fungerar som en antigen-presenterande cell) och en Jurkat klon (fungerar som en effektor helper T lymfocyter).
Syftet med metoden är att generera en immunologisk synaps (is), ett exempel på cell-till-cell konjugering bildas av en antigen-presenterande cell (APC) och en effektor helper T lymfocyter (th) cell, och att registrera bilder som motsvarar de första stadierna av ÄR bildande och efterföljande människohandel händelser (förekommer både i APC och i th-cellen). Dessa händelser kommer så småningom att leda till polariserad sekretion på IS. I detta protokoll, Jurkat celler utmanas med Staphylococcus av E (se)-pulsade Raji celler som en cell synaps modell användes, på grund av närheten av detta experimentella system till den biologiska verkligheten (th cell-APC synaptiska konjugat). Den metod som presenteras här innebär cell-till-cell konjugering, Time-lapse förvärv, wide-fältfluorescensmikroskopi (WFFM) följt av bildbehandling (efter förvärvet deconvolution). Detta förbättrar signal-brus-förhållandet (SNR) av bilderna, förbättrar den temporala upplösningen, tillåter synkroniserade förvärvet av flera fluorokromer i framväxande synaptiska konjugat och minskar fluorescens blekning. Dessutom är protokollet väl matchas med slutpunkt cell fixering protokoll (paraformaldehyd, aceton eller metanol), vilket skulle möjliggöra ytterligare immunofluorescensfärgning och analyser. Detta protokoll är också kompatibelt med laser scanning konfokalmikroskopi (LSCM) och andra State-of-the-art mikroskopi tekniker. Som en huvudsaklig varning, bara de T-cell-APC gränser (kallas är gränssnitt) som var till höger 90 ° vinkel till fokus planet längs Z-axeln kan vara korrekt avbildas och analyseras. Andra experimentella modeller finns att förenkla avbildning i Z-dimensionen och följande bildanalyser, men dessa metoder inte emulera komplexa, oregelbundna ytan av en APC, och kan främja icke-fysiologiska interaktioner i IS. Sålunda, den experimentella metoden som används här är lämplig att reproducera och att konfrontera vissa biologiska komplexitet som förekommer vid IS.
Det huvudsakliga målet med metoden är att generera immunologiska synaps (is) cell-till-cell konjugat bildas av en antigen-presenterande cell (APC) pulsade med se superantigener och en effektor th cell, och att registrera de bilder som motsvarar de första stadierna av immunologiska synapsen bildas och de efterföljande människohandel händelser (förekommer både i APC och Th-cellen), som så småningom kommer att leda till polariserad sekretion på is. Inrättandet av är av T-lymfocyter vid bindning av sin cell receptor (TCR) till antigener bundna till MHC-II på APC organiserar en extremt dynamisk, formbar och kritisk instans inblandade i antigen-specifika, humorala och cellulära immunsvar1,2. Is definieras av bildandet av en speciell Supramolekylära aktiverings komplex (SMAC) mönster som kännetecknas av en aktin omorganisation process3. Upon är byggandet av T-lymfocyter med en APC, den polarisering av sekretoriska blåsor mot är verkar vara inblandad i polariserad sekretion vid Synaptic gap. Denna fokuserade maskiner verkar entydigt förse immunförsvaret med en utmärkt reglerad knep för att öka effekten av kritiska sekretoriska effektor roller T-lymfocyter, samtidigt minska icke-specifik, cytokin-skiljemän stimulering av åskådare celler, dödande av irrelevanta målceller och apoptotiska självmord via aktivering-inducerad celldöd (aicd)4.
Följden av den är varierar på arten av både T-lymfocyter och APC. Den synaptiska kontakt av Th celler (typiskt CD4 + celler) med APC visar antigen-associerade till MHC-II ger aktivering av T-cellen (cytokin sekretion, proliferation, etc.) och, i vissa fall, apoptos via AICD4. För cytotoxiska T-lymfocyter (CTLs) (främst CD8 + celler) interagerar med APC presentera antigen I samband med MHC-I, resultatet skiljer sig på pre-stimulering eller inte av CTL med antigen. Sålunda, naiva CTL identifiera antigen-MHC-I komplex på APC är “primade” att förstöra målceller och dela. Primade CTL etablerar också synapser med målceller (dvs celler infekterade av virus eller tumörceller) som producerar antigen-specifik cell utrotning5,6.
Den polariserade utsöndringen av exosomer vid den immunologiska synapsen är ett utvecklande och utmanande forskningsområde som är involverat i relevanta immunsvar7. Det har visats att multivesikulär kroppar (MVB) som transporterar svalgmanometri vesikler (ilvs) upplever polariserad transport mot är8,9 (video 1) vid TCR-stimulering med antigen. Fusionen av dessa MVB på det Synaptic membranet inducerar deras degranulering och frigöraren av ilvs som undanflykt till den Synaptic cleften8,10. Detta sker i bildas av Th-typ Jurkat celler som ifrågasattes med se superantigen-belagda Raji celler som fungerar som APC11, TCR-STIMULERADE CD4+ lymfoblaster, och primade CTL. Således, synapser gjorda av Jurkat celler utgör en värdefull modell för att studera polariserad sekretorisk trafik av exosomes. Dessutom har flera decennier av utredning visat att många grundläggande insikter i TCR signalering kom från studier med transformerade T-cellslinjer, och faktiskt den mest kända av dessa modellsystem är Jurkat leukemi T-cells linje12.
Bildandet av en fullt utvecklad producerar flera avgörande biologiska resultat, inklusive aktivering av Th celler, aktivering av naiva ctls eller mål cell avlivning av primade CTL, bortsett från anergi eller aicd5. Därför, det finns två stora typer av sekretoriska är etablerad genom T-lymfocyter som resulterar i mycket varierande, men lika kritisk, immun effektor funktioner1,6,13. Å ena sidan, är från primade cytotoxiska T-lymfocyter (CTL) inducerar snabb polarisering (allt från sekunder till några minuter) av lytiska granulat (kallas “sekretoriska lysosomer”) mot IS. Den degranulering av lytiska granulat inducerar utsöndringen perforin och granzymes till den synaptiska spalten14, som är pro-apoptotiska molekyler. Det utsöndrande perforin och granzymes inducerar därefter dödande av målcellerna15,16. CTL utvecklar temporära synapser, som varar bara några minuter, som målcellerna mördas3,17. Detta beror förmodligen på den omständigheten att den optimala CTL uppgift kräver en snabb och tillfällig kontakt för att fördela så många dödliga strejker som möjligt till många målceller3,17. Däremot th lymfocyter som Jurkat celler generera stabila, långvariga är (från 10-30 min upp till timmar), eftersom detta verkar vara nödvändigt för både riktad och oupphörlig utsöndring av stimulerande cytokiner3,17. De cytokiner är också inneslutna i sekretoriska blåsor och några av dem (dvs., IL-2, IFN-γ) erfarenhet polariserad transport till är17 och sekretion. En viktig egenskap hos is är bildandet av undersökande, svaga och övergående kontakter mellan T-cellen och APC (video 1) som kan ge en starkare interaktion och inrättandet av en mogen är, förutsatt att TCR identifierar besläktat antigen-MHC komplex och att lämpliga Co-stimulatory anslutningar är etablerade5. Både början av de första kontakterna och grundandet av en mogen, helt produktiv är, är till sin natur stokastiska, snabba och asynkrona processer5,18. Dessutom finns det en knapp frekvens i skapandet av cell-till-cell-konjugat19, vilket kan utgöra en utmaning för avbildningstekniker (se resultat och diskussions avsnitt).
En annan huvudsaklig utmaning i att undersöka polarisering av Microtubule-organiserande Center (MTOC) och sekretoriska granulat i T-lymfocyter är att hela processen är snabb (sekunder till några minuter), särskilt i CTLs. med tanke på dessa fakta, de flesta tidiga tillvägagångssätt konfronteras en slutpunkt strategi där APC/målceller och T-lymfocyter blandas gemensamt och konvergeras av låg hastighet centrifugering, att gynna cell-till-cell konjugatbildande, inkuberas i flera minuter, fast och därefter utvärderas för omplacering av MTOC och/eller sekretoriska blåsor mot är20. Detta tillvägagångssätt har två betydande begränsningar: ingen livlig handel data uppnåddes och höga nivåer av bakgrund MTOC/sekretoriska granulat polarisering erhölls, förmodligen på grund av den stokastiska karaktär är etablering18. Vidare, varje korrelation mellan TCR-stimulerade, inledande signalering händelser (dvs., intracellulära kalcium stiger, aktin omorganisation) och sekretoriska vesikel polarisering är problematiskt att undersöka. Sålunda, tvingande bestämmelser för lämplig avbildning av IS i levande celler kombineras för att förbättra cell-till-cell konjugatet materialisering, att synkronisera generationen av IS och, när det är möjligt, att garantera inrättandet av cellulära konjugat på definierade Mikroskop XY fält och Z positioner. Flera strategier har utvecklats för att undvika alla dessa problem. Det är utanför tillämpningsområdet för denna uppsats att förklara dessa metoder, deras fördelar och svagheter. Se de tidigare publicerade recensionerna för att ta itu med dessa viktiga punkter1,4,5,21.
Det faktum att det görs av Th-lymfocyter är långlivade, och omständigheten att i th lymfocyter den MTOC, Lymphokine-innehållande sekretoriska granulat och MVB ta från flera minuter upp till timmar att flytta och docka till IS22 gör th-APC är en idealisk kandidat för avbildning med hjälp av protokollet som beskrivs här.
En begränsning av detta protokoll är att inte alla synapser kommer att vara idealiskt orienterade vinkelrätt mot den optiska axeln. Med hjälp av denna teknik, det finns inget sätt att förutsäga och/eller att påverka den idealiska orienteringen för immunsynapse Imaging. För att åtgärda detta problem utesluter vi från de efterföljande analyserna alla slumpmässigt fångade synapser som slutligen inte uppfyller de ideala kriterierna. Dessa synapser, lägligt nog, är inte mycket frekventerar. Det är dock möjligt att kringgå denna begränsning med hjälp av flera experimentella metoder4.
Den polariserade CD63 release (degranulation) kan kvantifieras genom andra kompletterande tekniker såsom cellyta färgning av CD63 (CD63 omlokalisering till cellytan) i levande celler (inte fast och inte permeabilized), efter steg 6, och efterföljande tvättning och fixering, som tidigare visat8. Dessutom kan CD63 release på undanflykt8,9 och exosome kvantifiering genom nanopartikel tracking analyser9,25 utföras. Dessa metoder är säkerligen förenliga med vårt protokoll, förutsatt fixering utförs efter cell ytan immunofluorescens av levande celler.
Vi har funnit det ideala antalet celler (för en 1 cm2 väl i 8-brunnen kammar bilden) är 4 x 105 celler (2 x 105 Raji celler och 2 x 105 Jurkat celler) eftersom de fäster effektivt till botten av brunnen. Bindande effektivitet till plast (med fibronectin), eller glasbotten (med poly-L-lysin) microslides är vanligtvis inte ett problem. Högre cell nummer kan inte ge några luckor bland de klibbande cellerna och därefter komplexa synaptiska konjugat (figur 1). båda situationerna är inte önskvärda när enstaka cell-till-cell konjugat måste avbildas i, till exempel, MTOC eller sekretoriska granule polarisering experiment. Lägre antal celler kan minska chanserna att hitta konjugat, särskilt när transfekterade Jurkat celler utmanas med APC att generera synapser. Observera att vi har observerat att en temperaturstabiliserad etapp inkubator på plats på mikroskopet X/Y skede före uppkomsten av protokollet (dvs., 1-2 h i förväg för att stabilisera scenen/Mikroskop Setup) upprätthåller stabila X, Y, Z parametrar, vilket är avgörande för korrekt avbildning. Automatiskt fokus system kommer så småningom att kompensera små Z variationer.
När vissa gen transduktion tekniker såsom elektroporation används för att uttrycka fluorescerande chimär proteiner (dvs., GFP-CD63) i Jurkat kloner (video 1), en avsevärd del av celler kan dö efter elektroporation. Detta kan vara ett problem eftersom även döda celler inte bildar synapser, när de är i överskott över de levande, transfekterade celler, de kan störa bildandet av konjugat från levande th celler. Vi har funnit att noggrann eliminering av döda celler från transfekterade kulturer med hjälp av en densitet gradient medium efter standardprotokoll innan konjugatbildningen steg kan verkligen öka chanserna att korrekt bild konjugat. Dessutom låg transfektioneffektiviseringar (< 20%) kan vara en viktig varning eftersom detta, kombinerat med en måttlig konjugatbildning effektivitet (ca 60%)25, kommer att minska sannolikheten för att hitta konjugat från transfekterade celler. Detta är inte ett problem när icke-transfected celler används för att erhålla konjugat i slutpunkts experiment och efterföljande fixering. 8 mikrobrunn kammar diabilder är kompatibla med konventionella immunofluorescenstest. Detta ökar flexibiliteten i ovanstående protokoll med olika syften. Fixering med aceton kan vara ett problem att tänka på när man använder kammar bilder med plast botten brunnar. Det finns dock kommersiellt tillgängliga 8 mikrobrunn Mikroskop kammare diabilder som innehåller glas bottnar, som är kompatibla med aceton fixering. Ta bort plast locken när aceton används för att fixera cellerna odlade i 8 mikrobrunn glasbotten kammare diabilder.
Det rekommenderas att mikroskopet är utrustat med en motoriserad XY skede, motoriserad EPI-Fluorescence torn och automatiskt fokus system (t. ex., perfekt fokus system) eller motsvarande tillägg. När multi-well förvärv krävs25, automatisk fokus systemet kommer att säkerställa ett stabilt fokus längs experimentet. Tidigare erfarenheter visar att genom att etablera en lämplig fokusförskjutning på Raji celler, både förflyttning av T-celler (video 1) och mikroskopet skede/kammar glidrörelser i XY Multi-punkt experiment, kan kompenseras. Detta är verkligen bekvämt för multispot tid-lapse Capture.
En svart och vit, pankromatisk och kyld laddad kopplad enhet (CDD) kamera användes men högre känslighet, fluorescens vetenskapliga komplementär metal-oxid Semiconductor (sCMOS) kamera är önskvärt, eftersom detta kommer att minska kamerans exponeringstider och kommer att öka temporala upplösning. Den korta exponeringstider för kameran vi har använt (ranking form 100 ms till 500 ms) kombinerat med den automatiska fluorescensslutaren möjliggör förlängd tidsfördröjning (upp till 24 timmar) med en tillräcklig tidsupplösning (1 ram per minut eller mindre, för upp till 16 XY positioner) utan signifikant fluorescens blekning och/eller förlust i cellernas lönsamhet. Den motoriserade scenen tillåter multi-Point (XY) fånga och ökar chansen att hitta och bild den framväxande och utveckla synapser i perfekt orientering, men också tillåter bild förvärv i multispot kammar bilder när olika Jurkat kloner måste samtidigt konjugerat25. Hög numerisk bländare av målet (dvs. 60x, 1,4) är nödvändigt för att få bästa resultat när man analyserar trafiken av sekretoriska granulat.
RAJI-SEE-Jurkat utgör en väletablerad immunologisk synapsemodell som har använts av en myriad av forskare sedan den ursprungligen beskrevs11. Vi har anpassat vårt protokoll till denna modell för att korrekt kunna avbilda de tidiga stadierna av IS formation. Vårt mål var att förbättra de tidiga metoderna20 tidigare följde för att studera polarisation av MTOC och sekretoriska maskiner mot is. Det är anmärkningsvärt att konjugaterna som göras med detta protokoll jordbruksprodukter F-Actin omorganisering på synapsen som konfigurerar en Canonical SMAC, concomitantly till MVBEN polariserat trafikera25. Dessa avgörande händelser har också analyserats och validerats av konfokalmikroskopi25.
Kinetiska skillnader i polariserad trafik finns bland olika typer av IS. Till exempel, den polariserade transporten av lytiska granulat från CTLs sker i sekunder eller mycket få minuter, medan flera cytokin-innehållande blåsor från th-lymfocyter ta från minuter upp till flera timmar att avsluta. Dessa temporala olikheter måste tas i beaktande i förväg, för att utforma den bästa strategin och att välja den lämpligaste experimentella och Imaging tillvägagångssätt, eftersom det för vissa Imaging knep (dvs, laser scanning konfokalmikroskopi (lscm)), kan tiden vara en begränsande faktor eftersom fångst tiden är mycket högre än lämplig tid upplösning (1 min eller mindre)4. Detta är inte en begränsning när bredfältfluorescensmikroskopi (WFFM) används enligt beskrivningen i protokollet ovan. Sedan i ctls, den polarisering av MTOC mot synapsen varar bara några minuter3,6,17, olika specifika State-of the art mikroskopi metoder skiljer sig från den som beskrivs här (men hyser högre rumsliga och temporala upplösning) är nödvändiga för att korrekt bild dessa synapser26,27, främst när flera mikroskopfält (Multi-Point Capture) avbildas. Dessa högupplösta, nya metoder kan också utnyttjas för avbildning av synapserna som th-lymfocyter, även om ekonomiska och/eller logistiska skäl (dvs, den kärnutrustning som krävs för vissa av dessa avbildningstekniker kostnader 6-7 gånger mer än den som beskrivs här) kan säkerligen utgöra en begränsning för dessa tillstånd av konsten Imaging metoder4. Det faktum att det görs av Th-lymfocyter är långlivade, och omständigheten att i th lymfocyter den MTOC, den Lymphokine-innehållande sekretoriska blåsor och MVB ta från flera minuter upp till timmar att transportera och docka till är22, gör detta protokoll en idealisk, prisvärd metod för avbildning av Th-APC är.
WFFM i kombination med efter förvärvet bild deconvolution utgör en intressant strategi och inte bara ekonomiska skäl stödja denna strategi. Den inneboende dålig upplösning i Z-axeln (den viktigaste förbehållet av tekniken) kan förbättras genom att använda efter förvärvet bild deconvolution4 (jämför video 1 med video 2). Deconvolution använder en beräkningsbaserad, bildbehandling metod som kan förbättra signal-brus-förhållande och bildupplösning och kontrast27 upp till 2 gånger, ner till 150-100 nm i XY-axeln och 500 Nm i Z-axeln4.
Användningen av högre känslighet, hög avläsning hastighet och brett dynamiskt omfång, nya fluorescens sCMOS kameror kommer att förbättra kvaliteten på bilderna och kommer att minska fluorescens blekning. Flexibiliteten som erbjuds av cell-till-cell konjugation protokoll som beskrivs här gör kombinationen av den beskrivna cellulära tillvägagångssätt med flera toppmoderna mikroskopi tekniker, både i levande celler men även i fasta celler, och det förväntade resultatet kommer verkligen att förbättra vår kunskap om den immunologiska synapsen.
Även om vi har genomfört och validerat protokollet genom att använda lätt-till-handtag, väletablerade cellinjer, den potentiella metoden kan tillåta visualisering av mer fysiologiska interaktioner när primära T-celler och olika typer av antigen-presenterande celler (såsom dendritiska celler av makrofager) används5. I detta sammanhang har detta protokoll också förlängts och validerats med hjälp av superantigen (SEB)-pulsad mus EL-4 cellinjer som används som en APC, att utmana primära mus T lymfoblaster9. Faktum primära T-lymfocyter, CTL i synnerhet, gjort mer kortlivade och dynamiska synaptiska kontakter (se kompletterande video 8 i referens9) till dem som SETTS med See-Raji och Jurkat modell. Variationen av synaptiska kontakt lägen kan bäst ses för primära T-cells interaktioner med dendritiska celler eller B-celler i tvådimensionella in vitro-vävnadsekvivalenter som också kan registreras och analyseras med hjälp av detta protokoll. Förutom superantigener kan tekniken användas för att avbilda andra typer av synapser. Till exempel kan den användas i en transgen TCR-antigen-specifik t-cellsmodell, till exempel genom att använda äggalbumin Specific murina OT1/OT2 system eller genom transfektion av t-celler med antigen-specifika t-cellreceptorer. Detta öppnar en myriad av experimentella möjligheter för den omedelbara framtiden.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner alla tidigare och nuvarande medlemmar i labbet för deras generösa bidrag. Detta arbete stöddes av bidrag från spanska Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), plan Nacional de Investigación Científica (SAF2016-77561-R till M.I., som delvis beviljades med FEDER-EC-finansiering). Vi erkänner Facultad de medicina (UAM) och Departamento de Audiovisuales av Facultad de medicina för deras stöd och de anläggningar som för att producera videon. Vi erkänner NIKON-Europe för det kontinuerliga och fantastiska tekniska och teoretiska stödet. Fri tillgång till denna artikel är sponsrad av Nikon.
Camera Nikon DS-QI1MC | Nikon | MQA11550 | Cooled Camera Head |
CMAC | ThermoFisher Scientific | C2110 | Cell tracker blue |
JURKAT cells | ATCC | ATCC TIB-152 | Effector T lymphocytes |
μ-Slide 8 well ibiTreat, μ-Slide 8 well Glass-Bottom | IBIDI | Cat.No: 80826, 80827 | Cell culture and cell imaging supports |
Microscope NIKON Eclipse Ti-E | Nikon | NIKON Eclipse Ti-E | Wide-field fluorescence, fully-motorized microscope equipped with Perfect Focus System (PFS) option |
Microscope Stage Incubator with 3-channel manual gas mixer and gas bubbler/ humidity module | OKOLAB | H201-NIKON-TI-S-ER | Cell culture atmosphere |
Raji Cells | ATCC | ATCC CCL-86 | APC |
RPMI medium GIBCO | ThermoFisher Scientific | 21875034 | Culture medium |
Streptococcus Enterotoxin E (SEE) | Toxin Technology, Inc | EP404 | Bacterial Toxin |
Software Huygens Essential | SVI | Huygens Essential | Image Deconvolution software |
Software Image J | NIH | Image J | Image software |
Software Nikon NIS-AR | Nikon | NIS-Elements AR | Image capture and analysis software |