Eine geschichtete Montagemethode für die verlängerte Zeitraffer-Konfokalmikroskopie ganzer Zebrafisch-Embryonen
Summary
Dieser Artikel beschreibt eine Methode zur Montage zerbrechlicher Zebrafischembryonen für eine längere konfokale Zeitraffermikroskopie. Diese kostengünstige Methode ist einfach mit normalen Glasbodenmikroskopie-Geschirr für die Bildgebung auf jedem invertierten Mikroskop durchzuführen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen.
Abstract
Auf die Entwicklungsdynamik kann eine konfokale Zeitraffermikroskopie lebender transgener Zebrafischembryonen folgen, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen ausdrücken. Ein Problem bei der Bildgebung der entwicklung ganzer Embryonen ist, dass Zebrafischembryonen erheblich in der Länge wachsen. Bei regelmäßiger Montage in 0,3-1% niedriger Schmelzagarose erzwingt die Agarose Wachstumseinschränkungen, was zu Verzerrungen im weichen Embryokörper führt. Doch um eine konfokale Zeitraffermikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Beweglichkeit der Embryonen einschränken und gleichzeitig das uneingeschränkte Wachstum ermöglichen. Die Montage erfolgt in Agaroseschichten in unterschiedlichen Konzentrationen. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu demonstrieren, wurde die entwicklung von ganzen Embryonen, Neuronalen und Muskeln 55 Stunden lang in transgenen Fischen abgebildet. Dieses Montageverfahren kann zur einfachen, kostengünstigen Abbildung ganzer Zebrafischembryonen mit invertierten Mikroskopen ohne Anforderungen an Formen oder spezielle Ausrüstung eingesetzt werden.
Introduction
Der Zebrafisch ist seit langem ein Modellorganismus für die Entwicklungsbiologie, und die Mikroskopie ist die wichtigste Methode, um die embryonale Entwicklung zu visualisieren. Die Vorteile der Verwendung von Zebrafischembryonen für Entwicklungsstudien sind geringe Größe, optische Klarheit, schnelle Entwicklung und hohe Fruchtbarkeit der erwachsenen Fische. Die Erzeugung transgener Zebrafischlinien, die Fluoreszenz in bestimmten Geweben oder Zellen exdrücken, hat eine direkte Visualisierung der Gewebeentwicklung auf eine Weise ermöglicht, die bei größeren Wirbeltieren nicht möglich ist. In Kombination mit der Zeitraffermikroskopie lassen sich Details und Dynamiken der Gewebeentwicklung leicht untersuchen.
Ein Problem bei der Bildgebung der Zebrafischentwicklung ist, dass die Embryonen erheblich in der Länge wachsen; der Embryo verlängert seine Länge viermal innerhalb der ersten 3 Tage des Lebens1. Auch der Körper des frühen Embryos ist weich und wird leicht verzerrt, wenn das Wachstum eingeschränkt wird. Doch um eine konfokale Mikroskopie durchführen zu können, muss der Embryo immobilisiert werden. Um Embryonen in einer festen Position für konfokale Zeitraffer-Bildgebung zu halten, werden sie regelmäßig beäscht und in 0,3-1% niedrigschmelzender Agarose montiert. Dies hat den Vorteil, dass während der Bildgebung für einen bestimmten Zeitraum ein gewisses Wachstum ermöglicht wird, während gleichzeitig die Bewegungen des Embryos eingeschränkt werden. Teile des Embryos können effizient so abgebildet werden. Bei der Verwendung dieser Methode zur Bildgebung des gesamten Embryos über einen längeren Zeitraum werden jedoch Verzerrungen aufgrund des durch die Agarose verursachten eingeschränkten Wachstums beobachtet. Daher sind weitere Montagemethoden erforderlich. Kaufmann und Kollegen haben eine alternative Montage von Zebrafischembryonen für die Lichtbogenmikroskopie beschrieben, wie z.B. die selektive Ebenenbeleuchtungsmikroskopie (SPIM), indem die Embryonen in fluorierten Ethylenpropylen (FEP)-Röhren montiert werden, die geringe Konzentrationen von Agarose oder Methylcellulose2enthalten. Diese Technik erzeugt eine hervorragende Visualisierung der Embryogenese im Laufe der Zeit. Schmid et al. beschreiben die Montage von bis zu sechs Embryonen in Agarose in FEB-Röhren für die Lichtbogenmikroskopie3, die die Visualisierung mehrerer Embryonen in einer Bildgebungssitzung ermöglicht. Formen wurden verwendet, um Embryo-Arrays für die effiziente Montage einer größeren Anzahl von Embryonen zu erstellen4. Masselkink et al. haben 3D-gedruckte Kunststoffformen konstruiert, die verwendet werden können, um Siliziumgüsse herzustellen, in denen Zebrafischembryonen in verschiedenen Stadien platziert werden können, was die Montage in einer konstanten Position für die Bildgebung ermöglicht, einschließlich konfokaler Bildgebung5. 3D-Druck wurde auch verwendet, um Formen für die konsistente Positionierung von Zebrafisch-Embryonen im 96-Well-Format6zu machen. Einige Formen sind für bestimmte Stufen angepasst und erlauben möglicherweise nicht uneingeschränktes Wachstum für längere Zeiträume, während andere Formen flexibler sind. Vor kurzem veröffentlichten Weijts et al. das Design und die Herstellung einer Vier-Brunnen-Schale für die Live-Bildgebung von Zebrafisch-Embryonen7. In dieser Schale werden Schwanz und Rumpf von anästhesierten Fischembryonen manuell unter einem klaren Silikondach platziert, das knapp über einem Deckglas befestigt ist, um eine Tasche zu bilden. Der Embryo wird dann in dieser Position durch die Zugabe von 0,4% Agarose fixiert. Diese Montage ermöglicht die Abbildung des etwa 2 mm langen hinteren Teils (Stamm und Schwanz) des Embryos, und da bis zu 12 Embryonen pro Bohrgut montiert werden können, ermöglicht das Verfahren die Abbildung mehrerer Proben. In ähnlicher Weise präsentierten Hirsinger und Steventon vor kurzem eine Methode, bei der der Kopf des Fisches in Agarose montiert ist, während der Schwanz frei wachsen kann, und diese Methode erleichtert auch effizient die Bildgebung des Rumpf- und Schwanzbereichs desEmbryos 8.
Dieser Artikel beschreibt eine geschichtete Montagemethode für Zebrafischembryonen, die die Bewegungen der Embryonen einschränken und gleichzeitig ein uneingeschränktes Wachstum ermöglichen. Die Vorteile dieser Montagemethode sind, dass es sich um eine kostengünstige, schnelle und einfache Methode zur Montage von Embryonen verschiedener Stadien für die Bildgebung mit jedem invertierten Mikroskop handelt. Die Montage ermöglicht eine langzeitige Bildgebung des ganzen Körpers (Kopf, Rumpf und Schwanz) während der Embryoentwicklung. Um die Nutzbarkeit dieser Methode zu zeigen, wurde die entwicklung von ganzen Embryonastagen, Neuronalen und Muskeln in transgenen Fischen dargestellt. Zwei Embryonen pro Sitzung, bei zwei Wellenlängen in 3D, wurden durch Zeitraffermikroskopie für 55 aufeinander folgende Stunden abgebildet, um Filme der Gewebeentwicklung zu rendern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier wird ein Montageverfahren zur erweiterten zeitraffenenkonfokalen Mikroskopie ganzer Zebrafischembryonen beschrieben. Der wichtigste Schritt für die Montagemethode besteht darin, die optimale Konzentration von Agarose zu identifizieren, die ein uneingeschränktes Wachstum von Zebrafischembryonen ermöglicht und gleichzeitig die Embryonen in einer vollständig fixierten Position für die konfokale Bildgebung hält. Da die optimale Konzentration von Agarose sehr gering ist, ist dieser Wert sehr empfindlich auf die Feh…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Albert Pan und Arndt Sieakmann für die Geschenke von transgenen Fischen. Wir danken Koichi Kawakami vom National Institute of Genetics, dem National BioResource Project des Ministeriums für Bildung, Kultur, Sport, Wissenschaft und Technologie Japans für die Gabe des transgenen Zebrafisches HGn39b. Wir danken auch Fatima Merchant und Kathleen Gajewski für die Unterstützung bei der konfokalen Mikroskopie und Tracey Theriault für Fotos.
Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Institute of Environmental Health Sciences der National Institutes of Health (Grant-Nummer P30ES023512 und Vertragsnummer HHSN273201500010C) unterstützt. SU wurde durch ein Stipendium des Keck Computational Cancer Biology Programms (Gulf Coast Consortia CPRIT Grant RP140113) und von Hugh Roy und Lillie Endowment Fund unterstützt. Unterstützt wurde er von der Robert A. Welch Foundation (E-0004).
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
Riferimenti
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