Un metodo di montaggio a strati per la microscopia confocale Time-Lapse estesa di embrioni di pesci zebra interi
Summary
Questo articolo descrive un metodo per montare fragili embrioni di pesce zebra per la microscopia confocale time-lapse estesa. Questo metodo a basso costo è facile da eseguire utilizzando normali piatti di microscopia con fondo di vetro per l’imaging su qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni.
Abstract
Le dinamiche di sviluppo possono essere seguite da microscopia confocale time-lapse di embrioni di pesce zebra transgenici vivi che esprimono fluorescenza in tessuti o cellule specifici. Una difficoltà con l’imaging dello sviluppo di embrioni interi è che gli embrioni di pesce zebra crescono notevolmente in lunghezza. Quando montato come regolarmente fatto in 0.3-1% agarose a bassa fusione, l’agarose impone restrizione di crescita, portando a distorsioni nel corpo embrionale morbido. Tuttavia, per eseguire la microscopia confocale time-lapse, l’embrione deve essere immobilizzato. Questo articolo descrive un metodo di montaggio stratificato per gli embrioni di pesce zebra che limitano la motilità degli embrioni, consentendo al contempo la crescita illimitata. Il montaggio viene eseguito in strati di agarose a diverse concentrazioni. Per dimostrare l’usabilità di questo metodo, lo sviluppo vascolare, neuronale e muscolare dell’intero embrione è stato immagine nei pesci transgenici per 55 ore consecutive. Questo metodo di montaggio può essere utilizzato per l’imaging facile e a basso costo di embrioni di pesci zebra interi utilizzando microscopi invertiti senza requisiti di stampi o attrezzature speciali.
Introduction
Il pesce zebra è stato a lungo un organismo modello per la biologia dello sviluppo, e la microscopia è il metodo principale per visualizzare lo sviluppo embrionale. I vantaggi dell’utilizzo di embrioni di pesce zebra per gli studi sullo sviluppo includono piccole dimensioni, chiarezza ottica, rapido sviluppo e alta fecondità del pesce adulto. La generazione di linee di pesci zebra transgenici che esprimono fluorescenza in alcuni tessuti o cellule ha permesso una visualizzazione diretta dello sviluppo dei tessuti in modi non possibili con animali vertebrati più grandi. In combinazione con la microscopia time-lapse, i dettagli e le dinamiche dello sviluppo dei tessuti possono essere facilmente studiati.
Una difficoltà con lo sviluppo di pesci zebra imaging è che gli embrioni crescono notevolmente in lunghezza; l’embrione estende la sua lunghezza quattro volte entro i primi 3 giorni di vita1. Inoltre, il corpo dell’embrione precoce è morbido e diventa facilmente distorto se la crescita è limitata. Tuttavia, per eseguire la microscopia confocale, l’embrione deve essere immobilizzato. Per mantenere gli embrioni in posizione fissa per l’imaging confocale time-lapse, sono regolarmente anestesizzati e montati in agarose a bassa fusione dello 0,3-1%. Questo ha il vantaggio di consentire una certa crescita durante l’imaging per un certo periodo di tempo, limitando al contempo i movimenti dell’embrione. Parti dell’embrione possono essere efficacemente immagini come questa. Tuttavia, quando si utilizza questo metodo per l’imaging dell’intero embrione per periodi di tempo prolungati, si osservano distorsioni a causa della crescita limitata causata dall’agarose. Pertanto, sono necessari altri metodi di montaggio. Kaufmann e colleghi hanno descritto un montaggio alternativo di embrioni di pesce zebra per la microscopia a fogli opaci, come la microscopia selettiva dell’illuminazione piana (SPIM), montando gli embrioni in tubi fluorurati di propilene di etilene (FEP) contenenti basse concentrazioni di agarose o metilcellulosa2. Questa tecnica produce una superba visualizzazione dell’embriogenesi nel tempo. Schmid e t al. descrivono il montaggio di fino a sei embrioni in agarose in tubi FEB per la microscopia light-sheet3 che fornisce la visualizzazione di diversi embrioni in una sessione di imaging. Le muffe sono state utilizzate per creare array di embrioni per un montaggio efficiente di un numero maggiore di embrioni4. Masselkink et al. hanno costruito stampi in plastica stampati in 3D che possono essere utilizzati per fare calchi di silicio in cui possono essere collocati embrioni di pesce zebra in diverse fasi, consentendo il montaggio in una posizione costante per l’imaging, compresa l’imaging confocale5. La stampa 3D è stata utilizzata anche per realizzare stampi per un posizionamento coerente degli embrioni di pesce zebra in formato 96-well6. Alcuni stampi sono personalizzati per alcune fasi e non possono consentire una crescita illimitata per lunghi periodi di tempo, mentre altri stampi sono più flessibili. Recentemente, Weijts ealtri ha pubblicato la progettazione e la fabbricazione di un piatto di quattro pozzi per l’imaging dal vivo di embrioni di pesce zebra7. In questo piatto, la coda e il tronco degli embrioni di pesce anestesizzati sono posizionati manualmente sotto un tetto in silicone trasparente attaccato appena sopra un vetro di copertura per formare una tasca. L’embrione viene quindi fissato in questa posizione con l’aggiunta dello 0,4% di agarose. Questo montaggio consente l’imaging della parte posteriore lunga circa 2 mm (tronco e coda) dell’embrione, e poiché fino a 12 embrioni possono essere montati per pozzo, il metodo consente l’imaging di più campioni. Allo stesso modo, Hirsinger e Steventon hanno recentemente presentato un metodo in cui la testa del pesce è montata in agarose, mentre la coda può crescere liberamente, e questo metodo facilita anche in modo efficiente l’imaging della regione del tronco e della coda dell’embrione8.
Questo articolo descrive un metodo di montaggio stratificato per gli embrioni di pesce zebra che limitano i movimenti degli embrioni, consentendo al contempo una crescita illimitata. I vantaggi di questo metodo di montaggio sono che si tratta di un metodo a basso costo, veloce e facile per montare embrioni di varie fasi per l’imaging utilizzando qualsiasi microscopio invertito. Il montaggio consente l’imaging a lungo termine di tutto il corpo (testa, tronco e coda) durante lo sviluppo dell’embrione. Per mostrare l’usabilità di questo metodo, lo sviluppo vascolare, neuronale e muscolare dell’intero embrione è stato immaginato nei pesci transgenici. Due embrioni per sessione, a due lunghezze d’onda in 3D sono stati immagini per microscopia time-lapse per 55 ore consecutive per rendere i filmati dello sviluppo dei tessuti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Un metodo di montaggio per la microscopia confocale time-lapse estesa di embrioni interi di pesci zebra è descritto qui. Il passo più critico per il metodo di montaggio è quello di identificare la concentrazione ottimale di agarose che permetterà la crescita senza restrizioni dell’embrione di pesce zebra e allo stesso tempo mantenere gli embrioni in una posizione completamente fissa per l’imaging confocale. Poiché la concentrazione ottimale di agarose è molto stretta, questo valore è molto sensibile agli errori di…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Albert Pan e Arndt Sieakmann per i doni di pesce transgenico. Ringraziamo Koichi Kawakami presso l’Istituto Nazionale di Genetica, il National BioResource Project del Ministero dell’Istruzione, della Cultura, dello Sport, della Scienza e della Tecnologia del Giappone per il dono del pesce zebra transgenico HGn39b. Ringraziamo anche Fatima Merchant e Kathleen Gajewski per l’assistenza sulla microscopia confocale, e Tracey Theriault per le fotografie.
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del National Institute of Environmental Health Sciences dei National Institutes of Health (numero di sovvenzione P30ES023512 e numero di contratto HHSN273201500010C). SU è stata sostenuta da una borsa di studio del programma Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) e da Hugh Roy e Lillie Endowment Fund. La Fondazione Robert A. Welch (E-0004) è stata sostenuta da J-O G.
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
Riferimenti
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