Pneumococcus-infectie van primaire humane endotheliale cellen in constante stroming

Summary

Deze studie beschrijft de microscopische monitoring van pneumococcus hechting aan Von Willebrand factor snaren geproduceerd op het oppervlak van gedifferentieerde menselijke primaire endotheliale cellen onder shear stress in gedefinieerde stromingsomstandigheden. Dit protocol kan worden uitgebreid naar gedetailleerde visualisatie van specifieke celstructuren en kwantificering van bacteriën door differentiële immunokleurings procedures toe te passen.

Abstract

Interactie van Streptococcus pneumoniae met het oppervlak van endotheel cellen wordt gemedieerd in de bloedstroom via mechanosensitieve eiwitten zoals de Von Willebrand factor (vwf). Deze glycoproteïne verandert de moleculaire conformatie in reactie op shear stress, waardoor binding sites bloot voor een breed spectrum van gastheer-ligand interacties. In het algemeen is het kweken van primaire endotheel cellen onder een gedefinieerde schuif stroom bekend om de specifieke celdifferentiatie te bevorderen en de vorming van een stabiele en strak gekoppelde endotheellaag die lijkt op de Fysiologie van de binnenbekleding van een bloedvat . Zo vereist de functionele analyse van interacties tussen bacteriële pathogenen en de gastheer-vasculatuur met mechanogevoelige eiwitten de oprichting van pompsystemen die de fysiologische stroom krachten kunnen simuleren die bekend zijn om het oppervlak van vasculaire cellen.

Het microfluïdische apparaat dat in deze studie wordt gebruikt, maakt een continue en pulseloze recirculatie van vloeistoffen met een gedefinieerde stroomsnelheid mogelijk. Het computergestuurde luchtdruk pompsysteem past een gedefinieerde shear stress op endotheliale celoppervlakken toe door een continue, unidirectionele en gecontroleerde gemiddelde stroom te genereren. Morfologische veranderingen van de cellen en bacteriële gehechtheid kunnen microscopisch worden bewaakt en gekwantificeerd in de stroom door gebruik te maken van speciale kanaal dia’s die zijn ontworpen voor microscopische visualisatie. In tegenstelling tot statische celkweek infectie, die in het algemeen een monster fixatie vereist voorafgaand aan immuun labeling en microscopische analyses, maken de microfluïdische dia’s zowel de fluorescentie-gebaseerde detectie van eiwitten, bacteriën en cellulaire componenten mogelijk na monster fixatie; seriële immunofluorescentie kleuring; en directe fluorescentiedetectie in real-time. In combinatie met fluorescerende bacteriën en specifieke fluorescentie-gelabelde antilichamen, deze infectie procedure biedt een efficiënte meervoudige component visualisatie systeem voor een groot spectrum van wetenschappelijke toepassingen met betrekking tot vasculaire processen.

Introduction

De pathogenese van pneumococcus-infecties wordt gekenmerkt door een veelzijdige interactie met een diversiteit aan extracellulaire matrix verbindingen en componenten van de menselijke hemostase, zoals plasminogeen envwf^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. De multi Domain glycoproteïne VWF fungeert als een belangrijke regulator van een evenwichtige hemostase door middel van bemiddeling van trombocyten werving en fibrinincorporatie op de plaats van vasculaire trombus formatie⁹. Het belang van functionele, actieve VWF voor bloedings beheersing en wondgenezing wordt aangetoond door de ziekte van Von Willebrand, een veelvoorkomend erfelijke bloedingsstoornis¹⁰.

Bolvormige vwf circuleert in het humaan bloedsysteem bij een concentratie van maximaal 14,0 μg/ml^11,10. Als reactie op vasculaire letsels is de lokale afgifte van vwf door endotheliale Weibel Palade Bodies (WBP) aanzienlijk toegenomen^11,12. Eerdere studies tonen aan dat de hechting van pneumococcus aan humane endotheelcellen en de productie van de Pore vormende toxine pneumolysine de Luminale VWF secretie¹³aanzienlijk stimuleert. De hydrodynamische krachten van de bloedstroom induceren een structurele opening van de mechanoresponsive VWF domeinen. Bij stroomsnelheden van 10 dyn/cm² de vwf multimerizes tot lange eiwit snaren tot enkele honderden micrometers in lengte die blijven gehecht aan het subendothelium^10,12.

Om te begrijpen van de functie van multimerized VWF snaren gegenereerd onder shear stress in de interactie van pneumococcus met het endotheliale oppervlak, een microfluidic gebaseerde cel cultuur infectie aanpak werd vastgesteld. Een microfluïdisch apparaat met een software-gestuurde luchtdruk pompsysteem werd gebruikt. Hierdoor kon een continue, unidirectionele recirculatie van het celkweekmedium met een gedefinieerde stroomsnelheid worden ingeschakeld. Daardoor paste het systeem een gedefinieerde shear stress op het oppervlak van endotheliale cellen, die bleef bevestigd in gespecialiseerde kanaal dia’s. Deze aanpak stelde de simulatie van de dwarskracht binnen de bloedstroom van het menselijke vasculaire systeem, waarbij VWF snaren worden gegenereerd op gedifferentieerde endotheliale cellen onder gedefinieerde constante stroom omstandigheden. Voor dit doel werden de endotheelcellen gekweekt in specifieke kanaal glaasjes (Zie tabel van materialen), die tijdens de stroming werden aangepast voor microscopische analyses. Het microfluïdische pompsysteem voorzag in de sterk gedefinieerde en gecontroleerde shear stresssituatie die nodig was voor de vorming van verlengde VWF snaren op de confluente endotheliale cellaag. Na de stimulatie van VWF-afscheiding van de door de mens geteelde humane navelstreng endotheliale cellen (HUVEC) door histamine suppletie, werd de snaar vorming geïnduceerd door het aanbrengen van een shear stress (ԏ) van 10 dyn/cm². De shear stress wordt gedefinieerd als de kracht die op de cellaag optreedt. Het wordt ongeveer berekend volgens Cornish et. al.¹⁴ met vergelijking 1:

Waarbij ԏ = afschuif spanning in dyn/cm², η = viscositeit in (DYN ∙ s)/cm², h = helft van de kanaal hoogte, w = de helft van de kanaal breedte en Φ = debiet in ml/min.

Het resultaat van vergelijking 1 is afhankelijk van de verschillende hoogtes en breedten van de verschillende gebruikte dia’s (Zie tabel met materialen). In deze studie werd een Luer-kanaal glijbaan van 0,4 μm gebruikt, resulterend in een kamer glijbaan factor van 131,6 (zie formule 2).

Viscositeit van het medium bij 37 °C is 0,0072 dyn ∙ s/cm ² en een shear stress van 10 dyn/cm ² werd gebruikt. Dit resulteerde in een debiet van 10,5 mL/min (Zie Formule 3).

Hier wordt de aanpassing en vooruitgang van een microfluïdische celculturing procedure met behulp van een unidirectioneel laminaire stroomsysteem voor het onderzoek en visualisatie van bacteriële infectiemechanismen in de gastheer-vasculatuur gedetailleerd beschreven. Het genereren van VWF-snaren op endotheliale lagen kan ook worden gestimuleerd door gebruik te maken van andere pompsystemen die in staat zijn om een continue en stabiele shear stress¹⁵toe te passen.

Na de teelt van primaire endotheelcellen tot samenvloeiing in stroming en stimulatie van VWF-snaar vorming, werden pneumokokken die rood fluorescentie-eiwit (RFP)¹⁶ uitdrukken, toegevoegd aan de endotheelcellaag onder constante microscopische controle. Het gehechtheid van bacteriën aan VWF-snaren op het oppervlak van endotheelcellen werd microscopisch gevisualiseerd en gedurende maximaal drie uur in real-time gemonitord door gebruik te maken van VWF-specifieke antilichamen met fluorescentie-label. Met deze aanpak werd de rol van VWF als adhesie cofactor voor het bevorderen van bacteriële gehechtheid aan het vasculaire endotheel bepaald⁸.

Naast de microscopische visualisatie van eiwit secretie en conformationele veranderingen, deze methode kan worden gebruikt voor het bewaken van enkele stappen van bacteriële infectie processen in real time en kwantificeren van de hoeveelheid bijgevoegde bacteriën op verschillende tijdstippen van Infectie. Het specifieke software-gestuurde pompsysteem biedt ook de mogelijkheid om de endotheelcellen in gedefinieerde constante stromingsomstandigheden gedurende maximaal enkele dagen te kweken en maakt een gedefinieerde gepulseerde-medium stroom incubatie mogelijk. Bovendien kan deze methode worden toegepast met behulp van verschillende celtypen. Het aanpassen van het kleurings protocol maakt ook de detectie en visualisatie van bacteriën geïnternationaliseerd in eukaryotische cellen mogelijk.

Dit manuscript beschrijft dit geavanceerde experimentele protocol, dat kan worden gebruikt als een gedefinieerde, betrouwbare en reproduceerbaar benadering voor een efficiënte en veelzijdige karakterisering van pathofysiologische processen.

Protocol

De microfluïdische celkweek werd uitgevoerd met commerciële primaire humane navelstreng endotheliale cellen (HUVEC). Het bedrijf isoleerde de cellen met geïnformeerde toestemming van de donor. Deze studie werd goedgekeurd door de ethische commissie van de kamer van de artsen van de federale staat Baden-Wuerttemberg met het referentienummer 219-04. Opmerking: Zie tabel met materialen voor protocol benodigdheden. 1. preultivatie van …

Representative Results

Het kweken van primaire huvec in een constante unidirectionele stroom resulteert in de vorming van een confluente en strak verpakte cellaag die de generatie van cellulaire wpbs bevordert, gevuld met de mechanosensitive vwf13,14. Dit protocol beschrijft het gebruik van een luchtdruk pomp-gebaseerd, pulseless recirculatiesysteem voor infectie analyse die vereist nabootsen van de shear stresssituatie in de menselijke bloedstroom. Dit syst…

Discussion

De simulatie van bacteriële interactie met mechanosensitieve gastheer eiwitten zoals VWF vereist een perfbruikbare celcultuursysteem dat het genereren van een gedefinieerde, unidirectionele en continue stroom van vloeistoffen mogelijk maakt, waardoor betrouwbaar shear stress wordt gegenereerd . Verschillende microfluïdische pompsystemen zijn al beschreven. Een uitgebreid overzicht van Bergmann et al. vat de belangrijkste aspecten van verschillende twee-en driedimensionale celcultuurmodellen¹⁷sam…

Materials

1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase	eBioscience now thermo fisher	00-4555-56	protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µl of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter	TPP	90026	subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	spinning down of bacteria (volumes of > 2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 – Z 216 M	spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing	ibidi	10821	for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37°C and 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37°C
Colombia blood agar plates	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Leica	DMi8	An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	used for PBS buffer
Drying material	Merck	101969	orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 µg / mL heparin, 1 µg / mL Hydrocortisone
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)	Promocell	C-22010	culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrome now Merck	S 0415	supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody	Abcam	ab8822	stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit	ibidi	10903	fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	for precoating of microslide channel surface
histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc73268	stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port	ibidi	10820	for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope	Zeiss	Axiovert 35M	inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump	ibidi	10905	air pressure pump
Neubauer cell counting chamber	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710-S	for cross linking of samples
Perfusion Set	ibidi	10964	Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37°C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)			the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes	Sarstedt	67,741	(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum	Pineda		raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate			this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
reaction tubes 1.5/ 2.0mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	required for antibody dilutions
reaction tubes with 50 mL volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
serological pipets 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)	Sigma Aldrich	451614-25G	for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G	for preparation of blocking buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract	oxoid	LP0021	bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY