Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Summary

Diese Studie beschreibt die mikroskopische Überwachung der Pneumokokken-Bindung an von Willebrand-Faktor-Strings, die auf der Oberfläche differenzierter menschlicher Primärendothelzellen unter Scherspannung unter definierten Strömungsbedingungen hergestellt werden. Dieses Protokoll kann auf eine detaillierte Visualisierung spezifischer Zellstrukturen und die Quantifizierung von Bakterien durch die Anwendung von Differential-Immunostaining-Verfahren erweitert werden.

Abstract

Die Wechselwirkung von Streptococcus pneumoniae mit der Oberfläche von Endothelzellen wird im Blutfluss über mechanosensitive Proteine wie den Von Willebrand Factor (VWF) vermittelt. Dieses Glykoprotein verändert seine molekulare Konformation als Reaktion auf Scherspannung und setzt so Bindungsstellen für ein breites Spektrum von Wirts-Ligand-Wechselwirkungen frei. Im Allgemeinen ist die Kultivierung von primären Endothelzellen unter einem definierten Scherfluss dafür bekannt, die spezifische zelluläre Differenzierung und die Bildung einer stabilen und eng verbundenen Endothelschicht zu fördern, die der Physiologie der inneren Auskleidung eines Blutgefäßes ähnelt. . Daher erfordert die funktionelle Analyse von Wechselwirkungen zwischen bakteriellen Krankheitserregern und der Wirtsvaskulatur mit mechanosensitiven Proteinen die Etablierung von Pumpensystemen, die die physiologischen Strömungskräfte simulieren können, von denen bekannt ist, dass sie die Oberfläche Gefäßzellen.

Das in dieser Studie verwendete mikrofluidische Gerät ermöglicht eine kontinuierliche und pulslose Rückführung von Flüssigkeiten mit einer definierten Durchflussrate. Das computergesteuerte Luftdruckpumpensystem wendet eine definierte Scherspannung auf endotheliale Zelloberflächen an, indem es einen kontinuierlichen, unidirektionalen und kontrollierten mittleren Durchfluss erzeugt. Morphologische Veränderungen der Zellen und bakterielle Anhaftung können im Fluss mikroskopisch überwacht und quantifiziert werden, indem spezielle Kanalschlitten verwendet werden, die für die mikroskopische Visualisierung entwickelt wurden. Im Gegensatz zur statischen Zellkulturinfektion, die im Allgemeinen eine Probenfixierung vor der Immunkennzeichnung und mikroskopischen Analysen erfordert, ermöglichen die mikrofluidischen Dias sowohl den fluoreszenzbasierten Nachweis von Proteinen, Bakterien und zellulären Komponenten. nach der Probenfixierung; serielle Immunfluoreszenzfärbung; und direkte fluoreszenzbasierte Detektion in Echtzeit. In Kombination mit fluoreszierenden Bakterien und spezifischen fluoreszenzmarkierten Antikörpern bietet dieses Infektionsverfahren ein effizientes Mehrkomponenten-Visualisierungssystem für ein riesiges Spektrum wissenschaftlicher Anwendungen im Zusammenhang mit gefäßbedingten Prozessen.

Introduction

Die Pathogenese von Pneumokokken-Infektionen ist durch eine facettenreiche Wechselwirkung mit einer Vielzahl von extrazellulären Matrixverbindungen und Komponenten der menschlichen Hämostase, wie Plasminogen und VWF^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. Das Multidomain-Glykoprotein VWF dient als Hauptregulator einer ausgewogenen Hämostase durch Vermittlung von Thrombozytenrekrutierung und Fibrin-Inkorporation am Standort der vaskulären Thrombusbildung⁹. Wie wichtig funktionelles, aktives VWF für die Blutungskontrolle und Wundheilung ist, zeigt die von Willebrand-Krankheit, eine häufige erbliche Blutungsstörung¹⁰.

Globular VWF zirkuliert im menschlichen Blutsystem in einer Konzentration von bis zu 14,0 g/ml^11,10. Als Reaktion auf Gefäßverletzungen ist die lokale Freisetzung von VWF durch endotheliale Weibel Palade Bodies (WBP) deutlich erhöht^11,12. Frühere Studien zeigen, dass die Pneumokokken-Bindung an menschliche Endothelzellen und seine Produktion des porenbildenden Toxins Pneumolysin die luminale VWF-Sekretion signifikant stimuliert¹³. Die hydrodynamischen Kräfte des Blutflusses induzieren eine strukturelle Öffnung der mechanoreagierenden VWF-Domänen. Bei Durchflussraten von 10 Dyn/cm² vermehrt sich der VWF zu langen Proteinsaiten von bis zu mehreren hundert Mikrometern Länge, die am Subendothel^10,12befestigt bleiben.

Um die Funktion von multimerisierten VWF-Strings zu verstehen, die unter Scherspannung im Zusammenspiel von Pneumokokken mit der endotheliaalen Oberfläche erzeugt werden, wurde ein mikrofluidischer Zellkulturinfektionsansatz etabliert. Es wurde ein mikrofluidisches Gerät mit einem softwaregesteuerten Luftdruckpumpensystem eingesetzt. Dies ermöglichte eine kontinuierliche, unidirektionale Rezirkulation des Zellkulturmediums mit einer definierten Durchflussrate. Dabei wendete das System eine definierte Scherspannung auf die Oberfläche von Endothelzellen an, die in speziellen Kanalschlitten befestigt blieben. Dieser Ansatz ermöglichte die Simulation der Scherkraft innerhalb des Blutstroms des menschlichen Gefäßsystems, bei der VWF-Strings auf differenzierten Endothelzellen unter definierten konstanten Strömungsbedingungen erzeugt werden. Zu diesem Zweck wurden die Endothelzellen in spezifischen Kanalgleitern (siehe Materialtabelle) kultiviert, die für mikroskopische Analysen während des Durchflusses angepasst wurden. Das mikrofluidische Pumpensystem lieferte die hochdefinierte und kontrollierte Scherspannungssituation, die für die Bildung von verlängerten VWF-Strings auf der konfluenten Endothelzellschicht erforderlich ist. Nach der Stimulation der VWF-Sekretion von konfluent gewachsenen menschlichen Nabelvenenenen-Endothelzellen (HUVEC) durch Histamin-Supplementierung wurde die Saitenbildung durch Anwendung einer Scherspannung von 10 Dyn/cm²induziert. Die Scherspannung ist definiert als die Kraft, die auf die Zellschicht einwirkt. Es wird ungefähr nach Cornish et berechnet. 14 mit Gleichung 1:

Wobei die Scherspannung in Dyn/cm², b = Viskosität in (dyn)/cm², h = die Hälfte der Kanalhöhe, w = die Hälfte der Kanalbreite und die Durchflussrate in mL/min.

Das Ergebnis von Gleichung 1 hängt von den verschiedenen Höhen und Breiten der verschiedenen verwendeten Folien ab (siehe Materialtabelle). In dieser Studie wurde ein Luer-Kanalschlitten von 0,4 m verwendet, was zu einem Kammerschieberfaktor von 131,6 führte (siehe Formel 2).

Viskosität des Mediums bei 37 °C beträgt 0,0072 Dyn/cm2 und es wurde eine Scherspannung von 10 Dyn/cm2 verwendet. Dies führte zu einem Durchfluss von 10,5 ml/min (siehe Formel 3).

Hier wird die Anpassung und Weiterentwicklung eines mikrofluidischen Zellkultivierungsverfahrens mit einem unidirektionalen laminaren Strömungssystem zur Untersuchung und Visualisierung bakterieller Infektionsmechanismen in der Wirtsvaskulatur ausführlich beschrieben. Die Erzeugung von VWF-Strings auf Endothelschichten kann auch durch andere Pumpensysteme angeregt werden, die eine kontinuierliche und stetige Scherspannung¹⁵auftragen können.

Nach der Kultivierung von primären Endothelzellen zur Zusammenflussung und Stimulation der VWF-Stringbildung wurden pneumokokken, die rotes Fluoreszenzprotein (RFP)¹⁶ exezieren, der Endothelzellschicht unter konstanter mikroskopischer Kontrolle zugesetzt. Die Befestigung von Bakterien an VWF-Saiten an der Oberfläche von Endothelzellen wurde mikroskopisch visualisiert und mit VWF-spezifischen fluoreszierenden Antikörpern bis zu drei Stunden in Echtzeit überwacht. Mit diesem Ansatz wurde die Rolle von VWF als Adhäsionskofaktor zur Förderung der bakteriellen Bindung an das vaskuläre Endothel bestimmt⁸.

Neben der mikroskopischen Visualisierung von Proteinsekretion und Konformationsveränderungen könnte diese Methode eingesetzt werden, um einzelne Schritte bakterieller Infektionsprozesse in Echtzeit zu überwachen und die Menge der angeschlossenen Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten von ansteckung. Das spezifische softwaregesteuerte Pumpensystem bietet zudem die Möglichkeit, die Endothelzellen in definierten konstanten Strömungsbedingungen bis zu mehreren Tagen zu kultitoren und ermöglicht eine definierte gepulste mittlere Strömungsinkubation. Darüber hinaus kann diese Methode mit verschiedenen Zelltypen angewendet werden. Die Anpassung des Färbeprotokolls ermöglicht auch die Detektion und Visualisierung von Bakterien, die in eukaryotische Zellen verinnerlicht sind.

Dieses Manuskript beschreibt dieses fortschrittliche experimentelle Protokoll, das als definierter, zuverlässiger und reproduzierbarer Ansatz für eine effiziente und vielseitige Charakterisierung pathophysiologischer Prozesse verwendet werden kann.

Protocol

Die mikrofluidische Zellkultivierung wurde mit kommerziellen primären menschlichen Nabelvenenen-Endothelzellen (HUVEC) durchgeführt. Das Unternehmen isolierte die Zellen mit informierter Zustimmung des Spenders. Diese Studie wurde von der Ethikkommission der Ärztekammer des Landes Baden-Württemberg mit der Referenznummer 219-04 genehmigt. HINWEIS: Siehe Tabelle der Materialien für Protokolllieferungen. 1. Präkultivierung der pri…

Representative Results

Die Kultivierung von primärer HUVEC in einem konstanten unidirektionalen Fluss führt zur Bildung einer konfluenten und dicht gepackten Zellschicht, die die Erzeugung von zellulären WPBs fördert, die mit dem mechanosensitiven VWF13,14gefüllt sind. Dieses Protokoll beschreibt den Einsatz eines luftdruckpumpenbasierten, pulslosen Rezirkulationssystems für die Infektionsanalyse, das die Scherstresssituation im menschlichen Blutfluss nachahmt. <p class="jove…

Discussion

Die Simulation der bakteriellen Interaktion mit mechanosensitiven Wirtsproteinen wie VWF erfordert ein durchwegsnutzbares Zellkultursystem, das die Erzeugung eines definierten, unidirektionalen und kontinuierlichen Flüssigkeitsflusses ermöglicht und so eine zuverlässige Scherspannung erzeugt. . Mehrere mikrofluidische Pumpensysteme wurden bereits beschrieben. Ein ausführlicher Überblick von Bergmann et al. fasst die Wesentlichen Aspekte verschiedener zwei- und dreidimensionaler Zellkulturmodelle^zus…

Materials

1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase	eBioscience now thermo fisher	00-4555-56	protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µl of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter	TPP	90026	subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	spinning down of bacteria (volumes of > 2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 – Z 216 M	spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing	ibidi	10821	for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37°C and 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37°C
Colombia blood agar plates	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Leica	DMi8	An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	used for PBS buffer
Drying material	Merck	101969	orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 µg / mL heparin, 1 µg / mL Hydrocortisone
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)	Promocell	C-22010	culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrome now Merck	S 0415	supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody	Abcam	ab8822	stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit	ibidi	10903	fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	for precoating of microslide channel surface
histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc73268	stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port	ibidi	10820	for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope	Zeiss	Axiovert 35M	inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump	ibidi	10905	air pressure pump
Neubauer cell counting chamber	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710-S	for cross linking of samples
Perfusion Set	ibidi	10964	Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37°C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)			the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes	Sarstedt	67,741	(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum	Pineda		raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate			this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
reaction tubes 1.5/ 2.0mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	required for antibody dilutions
reaction tubes with 50 mL volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
serological pipets 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)	Sigma Aldrich	451614-25G	for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G	for preparation of blocking buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract	oxoid	LP0021	bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY