Pneumococcus infeksjon av primær Human endothelial celler i konstant Flow

Summary

Denne studien beskriver mikroskopisk overvåking av pneumococcus overholdelse av von Willebrand faktor strenger produsert på overflaten av differensiert menneskelige primære endothelial celler under skjær stress i definerte strømningsforhold. Denne protokollen kan utvides til detaljert visualisering av spesifikke celle strukturer og kvantifisering av bakterier ved å bruke differensial immunostaining prosedyrer.

Abstract

Interaksjon av Streptococcus pneumoniae med overflaten av endothelial celler er mediert i blodstrøm via mechanosensitive proteiner som von Willebrand Factor (VWF). Dette glykoprotein endrer sin molekylære konformasjon som svar på skjær stress, og dermed utsette bindende områder for et bredt spekter av Host-ligand interaksjoner. Generelt, dyrking av primær endothelial celler under en definert skjær flyt er kjent for å fremme den spesifikke cellulære differensiering og dannelsen av en stabil og tett knyttet endothelial lag som likner fysiologi av indre foring av et blodkar . Dermed, funksjonell analyse av interaksjoner mellom bakterielle patogener og verten blodkar involverer mechanosensitive proteiner krever etablering av pumpesystemer som kan simulere fysiologiske strømnings krefter kjent for å påvirke overflaten av vaskulære celler.

Den mikrovæskebasert enheten som brukes i denne studien, muliggjør en kontinuerlig og pulseless resirkulering av væsker med en definert strømningshastighet. Det datastyrte Lufttrykks pumpesystemet anvender en definert skjærbelastning på endothelial celle overflater ved å generere en sammenhengende, enveis og kontrollert medium flyt. Morfologiske endringer av celler og bakteriell vedlegget kan mikroskopisk overvåkes og kvantifisert i flyten ved hjelp av spesielle kanal lysbilder som er utformet for mikroskopisk visualisering. I motsetning til statisk cellekultur infeksjon, som generelt krever en prøve fiksering før immun merking og mikroskopiske analyser, gjør de mikrovæskebasert lysbildene det mulig å både fluorescens deteksjon av proteiner, bakterier og cellulære komponenter etter prøve fiksering; seriell immunofluorescence farging; og direkte fluorescens deteksjon i sanntid. I kombinasjon med fluorescerende bakterier og spesifikke fluorescens antistoffer, gir denne infeksjonen prosedyren en effektiv flere komponent visualisering system for et stort spekter av vitenskapelige anvendelser knyttet til vaskulær prosesser.

Introduction

Den patogenesen av pneumococcus infeksjoner er preget av en mangesidig interaksjon med et mangfold av ekstracellulære matrise forbindelser og komponenter av den menneskelige hemostase, som plasminogen og VWF^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. Den replikasjonen glykoprotein VWF fungerer som nøkkel regulator av en balansert hemostase av formidling thrombocyte rekruttering og fibrin innlemmelse på stedet av vaskulær trombe formasjon⁹. Viktigheten av funksjonell, aktiv VWF for blødning kontroll og sår helbredelse er demonstrert av von Willebrand ‘ s sykdom, en felles arvelig blødning lidelse¹⁰.

Globular VWF sirkulerer i det menneskelige blod systemet ved en konsentrasjon på opptil 14,0 μg/ml^11,10. Som svar på vaskulær skade, den lokale utgivelsen av VWF av endothelial Weibel Palade organer (WBP) er markert økt^11,12. Tidligere studier viser at pneumococcus tilslutning til menneskelige endothelial celler og dens produksjon av pore-forming gift pneumolysin betydelig stimulerer luminal VWF sekresjon¹³. De hydrodynamisk kreftene i blodstrømmen induserer en strukturell åpning av mechanoresponsive VWF-domener. Ved strømningshastigheter på 10 Dyn/cm² VWF multimerizes til lange protein strenger på opptil flere hundre mikrometer i lengde som forblir festet til subendothelium^10,12.

For å forstå funksjonen av multimerized VWF strenger generert under skjær stress i samspillet av pneumococcus med endothelial overflaten, en mikrovæskebasert-basert cellekultur infeksjon tilnærming ble etablert. En mikrovæskebasert enhet med et programvarestyrt lufttrykk pumpesystem ble brukt. Dette aktiverte en kontinuerlig, veis resirkulering av cellekultur medium med en definert strømningshastighet. Dermed brukte systemet en definert skjær stress på overflaten av endothelial celler, som forble festet inne spesialiserte kanal lysbilder. Denne tilnærmingen aktivert simulering av skjærkraft i blodet av det menneskelige vaskulære system, der VWF strenger er generert på differensiert endothelial celler under definerte konstant strømningsforhold. For dette formålet ble de endothelial cellene dyrket i bestemte kanal lysbilder (se tabell over materialer), som ble tilpasset mikroskopiske analyser under flyten. Den mikrovæskebasert pumpen systemet gitt den svært definerte og kontrollerte skjær stress situasjonen kreves for dannelsen av utvidet VWF strenger på confluent endothelial celle laget. Etter stimulering av VWF-sekresjon av confluently vokst menneskelig navle vene endothelial celler (HUVEC) av histamin kosttilskudd, ble strengen formasjonen indusert ved å bruke en skjær stress (ԏ) på 10 Dyn/cm². Skjær stresset er definert som kraften opptrer på celle laget. Det beregnes omtrent i henhold til Cornish et. et al.¹⁴ med ligning 1:

Hvor ԏ = skjær stress i Dyn/cm², η = viskositet i (Dyn ∙ s)/cm², h = halvparten av kanal høyden, w = halvparten av kanalbredden, og Φ = Strømmens hastighet i ml/min.

Resultatet av ligningen 1 avhenger av de forskjellige høydene og breddene til de forskjellige lysbildene som brukes (se tabell over materialer). I denne studien en luer kanal lysbilde av 0,4 μm resulterer i et kammer lysbilde faktor på 131,6 ble brukt (se formel 2).

Viskositet av mediet ved 37 ° c er 0,0072 Dyn ∙ s/cm ² og et skjær stress på 10 Dyn/cm ² ble brukt. Dette resulterte i en strømningshastighet på 10,5 mL/min (se formel 3).

Her er tilpasning og fremme av en mikrovæskebasert celle dyrking prosedyre ved hjelp av en enveis laminær Flow system for etterforskning og visualisering av bakteriell infeksjon mekanismer i verten blodkar er beskrevet i detalj. Generering av VWF strenger på endothelial lag kan også stimuleres ved hjelp av andre pumpesystemer som er i stand til å bruke en kontinuerlig og jevn skjær stress¹⁵.

Etter dyrking av primær endothelial celler til samløpet i flyt og stimulering av VWF streng formasjon, pneumokokker uttrykke røde fluorescens protein (RFP)¹⁶ ble lagt til endothelial celle laget under konstant mikroskopisk kontroll. Vedlegget av bakterier til VWF strenger på overflaten av endothelial celler ble mikroskopisk visualisere og overvåket i opptil tre timer i sanntid ved hjelp av VWF-spesifikke fluorescerende-merket antistoffer. Med denne tilnærmingen, rollen som VWF som en vedheft kofaktor fremme bakteriell vedlegg til vaskulær endotelet ble bestemt⁸.

I tillegg til mikroskopisk visualisering av protein sekresjon og conformational endringer, denne metoden kan brukes til å overvåke enkelt trinn av bakteriell infeksjon prosesser i sanntid, og å kvantifisere mengden av vedlagte bakterier på ulike tidspunkt poeng av Infeksjon. Den spesifikke programvaren-kontrollerte pumpesystemet gir også muligheten til å kultur de endothelial cellene i definerte konstante strømningsforhold i opptil flere dager og muliggjør en definert pulserende medium Flow inkubasjons. Videre kan denne metoden brukes ved hjelp av forskjellige celletyper. Tilpassing av farge protokollen gjør det også mulig å oppdage og visualisere bakterier som internalisert inn i eukaryote celler.

Dette manuskriptet beskriver denne avanserte eksperimentelle protokollen som kan brukes som en definert, pålitelig og reproduserbar tilnærming for en effektiv og allsidig karakterisering av patofysiologiske prosesser.

Protocol

Den mikrovæskebasert celle dyrking ble utført med kommersielle primære menneskelige navle vene endothelial celler (HUVEC). Selskapet isolerte cellene med informert samtykke fra donor. Denne studien ble godkjent av etikk Committee of Doctors Chamber av Federal State Baden-Wuerttemberg med referansenummer 219-04. Merk: Se tabell over materialer for protokoll forsyninger. 1. Precultivation av primær endothelial celler Tin…

Representative Results

Dyrking primære HUVEC i en konstant enveis flyt resulterer i dannelsen av en confluent og tett pakket celle laget som fremmer generering av cellulære WPBs fylt med mechanosensitive VWF13,14. Denne protokollen beskriver bruk av et lufttrykk pumpebasert, pulseless resirkuleringssystem for infeksjon analyse som krever etterligne skjær stress situasjonen i den menneskelige blodstrømmen. Dette systemet muliggjør en definert, programvar…

Discussion

Simulering av bakteriell interaksjon med mechanosensitive vert proteiner som VWF krever en perfusable cellekultur system som gjør det mulig generering av en definert, enveis, og kontinuerlig strøm av væsker, og dermed generere pålitelig skjær stress . Flere mikrovæskebasert pumpesystemer er allerede beskrevet. En omfattende gjennomgang fra Bergmann et al. oppsummerer de viktigste aspektene ved ulike to-og tre-dimensjonal cellekultur modeller¹⁷.

Den mikrovæskebase…

Materials

1 mL Luer-syringe	Fisher Scientific	10303002	with 1 mL volume for gelatin injection using the luer-connection of the slides
2 mL Luer-syringe	Sarstedt	9077136	For pieptting/injecting fluids into the luer connections of the channel chamber slides
Accutase	eBioscience now thermo fisher	00-4555-56	protease mix used for gentle detachment of endothelial cells
AlexaFluor350-conjugated Phalloidin	Abcam	ab176751	no concentration available from the manufacturer, stock solution is sufficient for 300 tets, company recommends to use 100 µl of a 1:1000 dilution, blue fluorescence (DAPI-filter settings)
AlexaFluor488-conjugated goat-derived anti-mouse antibody	Thermo Fisher Sientific	A11001	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of human VWF in microfluidic slide after PFA fixation, green fluorescence
AlexaFluor568-conjugated goat-derived anti-rabbit-antibody	Thermo Fisher Scientific	A-11011	stock concentration: 2 mg/mL for immunostaining of pneumococci in microfluidic slide after pFA fixation, red fluorescence
Bacto Todd-Hewitt-Broth	Becton Dickinson GmbH	BD 249210	complex bacterial culture medium
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma Aldrich	A2153-25G	solubilized, for preparation of blocking buffer
Cell culture flasks with filter	TPP	90026	subcultivation of HUVEC in non-coated cell culture flasks of 25 cm2 surface
Centrifuge Allegra X-12R	Beckman Coulter Life Sciences	392304	spinning down of bacteria (volumes of > 2mL)
Centrifuge Allegra X-30	Beckman Coulter Life Sciences	B06314	spinning down of eukaryotic cells
Centrifuge Z 216 MK	Hermle	305.00 V05 – Z 216 M	spinning down of bacteria (volumes of less than 2 mL)
Chloramphenicol	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3886.2	used in a concentration of 0.2 /mL for cultivation of pneumococci transformed with genetic construct carrying red fluorescent protein and chloramphenicol resistance cassette
Clamp for perfusion tubing	ibidi	10821	for holding the liquid in the tube bevor connecting the slide to the pump system
CO2-Incubator	Fisher Scientific	MIDI 40	incubator size is perfectly adapted to teh size of the fluidic unit with connected channel slide and was used for flow cultivation at 37°C and 5% CO2
CO2-Incubator	Sanyo	MCO-18 AIC	for incubation of bacteria and cells in a defined atmosphere at 5% CO2 and 37°C
Colombia blood agar plates	Becton Dickinson GmbH	PA-254005.06	agar-based complex culture medium for S. pneumoniae supplemented with 7% sheep blood
Computer	Dell	Latitude 3440	Comuter with pressure pump software
Confocal Laser Scanning Microscope (CLSM)	Leica	DMi8	An inverse microscope with a stage covered by a heatable chamber and with a fluorescence unit equipped with fluorescence filter, Xenon-light source (SP8, DMi8) and DFC 365 FX Kamera (1392 x 1040, 1.4 Megapixel)
Di Potassium hydrogen phosphate (KH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	3904.1	used for PBS buffer
Drying material	Merck	101969	orange silica beads for drying used in a glass bottle with a tubing adaptor
ECGM supplement Mix	Promocell	C-39215	supplement mix for ECGM -medium, required for precultivation of endothelial cells: 0.02 mL/mL Fetal calf serum, 0.004 mL/ mL endothelial cell growth supplement, 0.1 ng / mL epidermal growth factor, 1 ng / mL basic fibroblast growth factor, 90 µg / mL heparin, 1 µg / mL Hydrocortisone
ECGMS	Promocell	C-22010	ECGM supplemented with 5 % [w/w] FCS and 1 mM MgSO4 to increase cell adhesion
Endothelial Cell growth medium (ECGM, ready to use)	Promocell	C-22010	culture medium of HUVECs, already supplemented with all components of the supplement mix
Fetal Calf Serum (FCS)	biochrome now Merck	S 0415	supplement for cell culture, used for infection analyses
FITC-conjugated goat anti-human VWF antibody	Abcam	ab8822	stock concentration: 10 mg/mL, for immunodetection of globular and multimerized VWF in flow
Fluidic Unit	ibidi	10903	fluidic unit for flow cultivation
Gelatin (porcine)	Sigma Aldrich	G-1890-100g	for precoating of microslide channel surface
histamine dihydrochloride	Sigma Aldrich	H-7250-10MG	for induction of VWF secretion from endothelial Weibel Palade Bodies
Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC)	Promocell	C-12203 Lot-Nr. 396Z042	primary endothelial cells from pooled donor, stored crypcoserved in liquid nitrogen
Human VWF-specific antibody derived from mouse (monoclonal)	Santa Cruz	sc73268	stock concentration: 200 µg/mL for immunostaining of VWF in microfluidic slide after PFA fixation
Injection Port	ibidi	10820	for injection of histamin or bacteria into the reservoir tubing during the flow circulation
Light microscope	Zeiss	Axiovert 35M	inverse light microscope for control of eukaryotic cell detachement and cell counting using a 40 x water objective allowing 400 x magnification
Luer-slides I0.4 (ibiTreat472microslides)	ibidi	80176	physically modified slides for fludic cultivation (μ–Slide I0.4Luer with a channel hight of 0.4 mm, a channel volume of 100 μl, a growth area of 2.5 cm and a coating area of 25.4 cm2) suitable for all kinds of flow assay, the physical treatment generates a hydrophilic and adhesive surface.
Magnesium sulfate (MgSO4, unhydrated)	Sigma Aldrich	M7506-500G	For preparation of ECGMS medium
Microfluidic Pump	ibidi	10905	air pressure pump
Neubauer cell counting chamber	Karl Hecht GmbH&Co KG	40442002	microscopic counting chamber for HUVECs
Paraformaldehyde 16% (PFA)	Electron Microscopy Sciences	15710-S	for cross linking of samples
Perfusion Set	ibidi	10964	Perfusion Set Yellow/Green has a tubing diameter of 1.6 mm, a tube length of 50 cm, a total working volume of 13.6 mL, a dead tube volume of 2.8 mL and a reservoir size of 10 mL. combined with the µ-slide L0.4Luer, at 37°C and a viscosity of 0.0072 dyn x s/cm2 a flow rate range of 3.8mL/min up to 33.9 mL/min and shear stress between 3.5 dyn/cm2 and 31.2 dyn/cm2 can be reached. with 50 cm lenght for microfluidic
Phosphate-buffered saline (PBS)			the solution was prepared using the following chemicals: 0.2 g/L KCl, 1.44 g/L Na2HPO4, 0.24 g/L KH2PO4 , pH 7.4
Plastic cuvettes	Sarstedt	67,741	(2 x optic) for OD measurement at 600 nm
Pneumococcus-specific antiserum	Pineda		raised in rabbit using heat-inactivated Streptococcus pneumoniae NCTC10319 and D39, IgG-purified using proteinA-sepharose column.
Polystyrene or Styrofoam plate			this is a precaution step to avoid cold stress on the cells seeded in the channel slides. Any type of styrofoam such as packaging box-material can be used. The plate might by 0.5 cm thick and should have a size of 20 cm2.
Potassium chloride (KCl)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	6781.1	used for PBS buffer
Pump Control Software (PumpControl v1.5.4)	ibidi	v1.5.4	Computer software for controlling the pressure pump, setting the flow conditions and start/end the flow
reaction tubes 1.5/ 2.0mL	Sarstedt	72.706/ 72.695.500	required for antibody dilutions
reaction tubes with 50 mL volume	Sarstedt	6,25,48,004
RFP-expressing pneumococci	National Collection of Type Cultures, Public Health England	10,319	Streptococcus pneumoniae serotype 47 expressing RFP fused to ahistone-like protein integrated into the genome
serological pipets 5, 10 mL	Sarstedt	86.1253.025/ 86.1254.025	for pipeting larger volumes
Sodium Carbonate (Na2CO3, water free)	Sigma Aldrich	451614-25G	for preparation of 100 mM Sodium Carbonate buffer
Sodium dihydrogen phosphate (NaH2PO4)	Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe	P030.2	used for PBS buffer
Spectral Photometer Libra S22	Biochrom	80-2115-20	measurement of optical density (OD) of bacterial suspension at 600 nm
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G	for preparation of blocking buffer
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284-500ML	Used in 0.1% end concentration diluted in dH20 for eukaryotic cell permeabilization after PFA fixation
Yeast extract	oxoid	LP0021	bacteria are cultivated in THB supplement with 1% [w/w] yeast extract = complete bacterial cultivation medium THY