زخرفه هندسه مستعمرات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية علي ركائز متوافقة للتحكم في ميكانيكا مستوي الانسجه
Summary
يمكن ان تكون منقوشة الدهون مصفوفة خارج الخلية علي المواد الهلامية بولياكريلاميد لتمكين ثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات المحصورة علي ركائز متوافقة. ويمكن الجمع بين هذه الطريقة مع المجهر قوه الجر والاختبارات البيوكيميائية لفحص التفاعل بين هندسه الانسجه ، والقوات المتولدة من الخلايا ، ومواصفات مصير.
Abstract
تظهر الخلايا الجذعية الجنينية البشرية قدره فريدة علي الاستجابة للموفوينات في المختبر من خلال أنماط التنظيم الذاتي لمواصفات مصير الخلية التي تتوافق مع تكوين الطبقة الجرثومية الاوليه اثناء الاجنه. التالي ، تمثل هذه الخلايا أداه قويه لدراسة أليات التي تدفع بالتنمية البشرية المبكرة. لقد وضعنا طريقه للثقافة الخلايا الجذعية الجنينية البشرية في المستعمرات المحصورة علي ركائز المتوافقة التي توفر السيطرة علي كل من هندسه المستعمرات وبيئتها الميكانيكية من أجل تلخيص المعلمات المادية التي تكمن وراء تولد الاجنه. الميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو القدرة علي توليد الهلام المائي بولياكريلاميد مع أنماط محدده من الخلايا مصفوفة خارج الخلية علي السطح لتعزيز المرفقات الخلية. ويتحقق ذلك عن طريق افتعال الاستنسل مع الأنماط الهندسية المطلوبة ، وذلك باستخدام هذه الاستنسل لخلق أنماط من الخلايا مصفوفة خارج الخلية علي الزجاج الشفتين ، ونقل هذه الأنماط إلى بولياكرياميد هيدروجيل خلال البلمره. هذا الأسلوب هو أيضا متوافق مع المجهر قوه الجر ، مما يسمح للمستخدم لقياس وتعيين توزيع القوات التي تولدها الخلايا داخل المستعمرات المحصورة. في تركيبه مع اختبارات الكيمياء الحيوية القياسية ، ويمكن استخدام هذه القياسات لفحص دور العظة الميكانيكية اللعب في تحديد المصير و تخلق خلال التنمية البشرية في وقت مبكر.
Introduction
الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) تحمل وعدا كبيرا لاستخدامها في الطب التجديدي وتطبيقات هندسه الانسجه. الطبيعة المستحثة لهذه الخلايا تمنحهم القدرة علي التفريق في اي نوع من أنواع الخلايا البالغة. وعلي الرغم من الخطوات الكبيرة التي تم القيام بها في توجيه مصير hESCs إلى أنواع معينه من الخلايا ، فقد ظل من الصعب جدا توليد انسجه كامله أو أجهزه من نوفو1،2،3،4، 5– ويرجع ذلك ، في جزء كبير منه ، إلى فهم محدود للأليات التي تقود تشكيل هذه الانسجه اثناء التنمية البشرية. ومن أجل سد هذه الفجوة في المعرفة ، برز عدد من الطرق في السنوات الاخيره لنمذجة الاجنه المبكرة والمراحل اللاحقة من التنمية مع الخلايا الجذعية الجنينية6،7،8،9 ،10،11،12،13.
بعد فتره وجيزة من اشتقاق الخطوط الاولي لل hESC14، ثبت ان الأجسام الجنينية التي تشكلت من hesc كانت قادره علي إنتاج خلايا تلقائيا من الطبقات الجرثومية الاوليه الثلاثة6. ومع ذلك ، ونظرا للافتقار المتاصل في السيطرة علي حجم وشكل الأجسام الجنينية ، فان تنظيم الطبقات الجرثومية اختلف كثيرا وأخفق في مضاهاة تنظيم الجنين المبكر. في الاونه الاخيره ، وارفلش وآخرون وضعت طريقه لحصر مستعمرات hESCs علي ركائز الزجاج عن طريق ميكروباتيرنينج ، وتوفير السيطرة والاتساق علي حجم وهندسه المستعمرات8. وفي وجود BMP4 ، وهو من المتحولين المهمين في التنمية المبكرة ، كانت هذه المستعمرات المحصورة قادره علي التنظيم الذاتي لأنماط قابله للتكرار من المواصفات لمصائر تمثل الطبقات الجرثومية الاوليه. وعلي الرغم من ان هذا يوفر نموذجا مفيدا لدراسة أليات التي يتم بها إنشاء طبقات الجرثومية الاوليه ، فان أنماط تحديد المصير لم تتطابق تماما مع التنظيم والنشاه التي لوحظت اثناء تولد الاجنه15. وقد تحققت خلاصه أكثر إخلاصا للتنمية الجنينية المبكرة من خلال تضمين الشهادات في مصفوفة ثلاثية الابعاد (ECM) من المصفوفة11، وتوفير اقوي الادله حتى الآن لقدره hescs علي التنظيم الذاتي والنموذج المراحل المبكرة من الاجنه الجسم السابق. ومع ذلك ، فان هذه الطريقة تسفر عن نتائج غير متسقة التالي فهي تتنافى مع عدد من المقايسات التي يمكن استخدامها للكشف عن أليات الاساسيه للتنظيم الذاتي ومواصفات المصير.
النظر إلى هذه الأساليب القائمة والقيود الخاصة بكل منها ، سعينا إلى تطوير طريقه للتكرار المستعمرات hESC من الهندسي المحددة في الظروف التي نموذج البيئة خارج الخلية من الجنين في وقت مبكر. لتحقيق ذلك ، استخدمنا polyالاكريلاميد هيدروجيل من مرونة انضباطي للسيطرة علي الخواص الميكانيكية للركيزة. باستخدام المجهر القوه الذرية علي أجنه الدجاج مرحله التذوق ، وجدنا ان مرونة العدسة تراوحت من مئات باسكال إلى عدد قليل من kilopascals. وهكذا ، ركزنا علي توليد الهلام المائي بولياكريلاميد مع مرونة في هذا النطاق لتكون بمثابه الركيزة لمستعمرات hESC. قمنا بتعديل طرقنا السابقة لزراعه الدهون علي بولياكرياميد هيدروجيل7،9 لتوفير السيطرة القوية علي هندسه المستعمرات. حققنا هذا من قبل الأول زخرفه ECM ligands ، وهي الأمومي ، علي الزجاج coverslips من خلال الاستنسل المجهرية ، كما ذكرت سابقا16. ثم قمنا بتصميم تقنيه جديده لنقل الاربطه المنقوشة إلى سطح الهلام المائي بولياكريلاميد خلال البلمره. الأسلوب الذي وصفناه هنا ينطوي علي استخدام التصوير الضوئي لصنع رقاقه السيليكون مع الأنماط الهندسية المطلوبة ، وخلق الطوابع من الميزات الهندسية مع polydimethylsiloxane (PDMS) ، واستخدام هذه الطوابع لتوليد الاستنسل التي تسمح في نهاية المطاف زخرفه من يجند علي سطح الشفتين الزجاجية ونقل إلى بولياكرياميد.
بالاضافه إلى تلخيص البيئة الميكانيكية للجنين في وقت مبكر ، وحصر المستعمرات hESC علي polyالاكريلاميد تمكن قياس القوات المتولدة من الخلايا مع المجهر قوه الجر (TFM) ، كما ذكر في الطريقة السابقة9لدينا. باختصار ، يمكن ان تكون جزءا لا يتجزا من حبات الفلورسنت في بولياكريلاميد وتستخدم كعلامات ايماني. وتحسب القوات المتولدة من الخلايا عن طريق تصوير أزاحه هذه الخرز بعد البذر hESCs علي الركيزة منقوشة. وعلاوة علي ذلك ، يمكن الجمع بين خرائط قوه الجر الناتجة مع المقايسات التقليدية ، مثل المناعة ، لدراسة كيف يمكن لتوزيع القوات المتولدة من الخلايا في مستعمرات التردد الضيق المحصورة ان ينظم أو يعدل الإشارات الاماميه. ونتوقع ان تكشف هذه الأساليب عن ان القوات الميكانيكية تلعب دورا حاسما في زخرفه مواصفات قدر الخلية خلال التنمية الجنينية المبكرة التي يتم تجاهلها حاليا.
Protocol
Representative Results
Discussion
لتبسيط بروتوكول طويل ومفصل ، وهذا الأسلوب يتكون من ثلاث مراحل حرجه: 1) توليد أنماط من الربط ECM وعلي الزجاج الشفتين ، 2) نقل أنماط إلى بولياكرياميد هيدروجيل خلال البلمره من هلام ، و 3) البذر hESCs علي منقوشة هيدروجيل. وهناك خطوات حاسمه يجب النظر فيها في كل من هذه المراحل الثلاث. من أجل توليد أنماط ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود ان نعترف بالتمويل من منحه CIRM RB5-07409. J.M.M. يود ان يشكر FuiBoon كاي ، Dhruv ثازار ، وروجر اوريا للمناقشات المختلفة التي استرشدت الجيل واستكشاف الأخطاء وإصلاحها من هذه الطريقة. كما يشكر J.M.M. الزمالة الاستكشافية لشركه UCSF للدعم المستمر لعمله.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Riferimenti
- Tabar, V., Studer, L. Pluripotent stem cells in regenerative medicine: Challenges and recent progress. Nature Reviews Genetics. 15, 82-92 (2014).
- Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 170-182 (2016).
- Trounson, A., DeWitt, N. D. Pluripotent stem cells progressing to the clinic. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 17, 194-200 (2016).
- Li, Y., Li, L., Chen, Z. N., Gao, G., Yao, R., Sun, W. Engineering-derived approaches for iPSC preparation, expansion, differentiation and applications. Biofabrication. 9 (3), 032001 (2017).
- Stevens, K. R., Murry, C. E. Human Pluripotent Stem Cell-Derived Engineered Tissues: Clinical Considerations. Cell Stem Cell. 22 (3), 294-297 (2018).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies comprising the three embryonic germ layers. Molecular Medicine. 6 (2), 88-95 (2000).
- Lakins, J. N., Chin, A. R., Weaver, V. M., Mace, K., Braun, K. Exploring the link between human embryonic stem cell organization and fate using tension-calibrated extracellular matrix functionalized polyacrylamide gels. Progenitor Cells. Methods in Molecular Biology (Methods and Protocols). 916, 317-350 (2012).
- Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nature Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Sunyer, R., Trepat, X., Weaver, V. M. Monitoring developmental force distributions in reconstituted embryonic epithelia. Methods. 94, 101-113 (2016).
- Przybyla, L., Lakins, J. N., Weaver, V. M. Tissue Mechanics Orchestrate Wnt-Dependent Human Embryonic Stem Cell Differentiation. Cell Stem Cell. 19 (4), 462-475 (2016).
- Shahbazi, M. N., et al. Self-organization of the human embryo in the absence of maternal tissues. Nature Cell Biology. 18, 700-708 (2016).
- Shao, Y., Taniguchi, K., Townshend, R. F., Miki, T., Gumucio, D. L., Fu, J. A pluripotent stem cell-based model for post-implantation human amniotic sac development. Nature Communications. 8 (208), 1-15 (2017).
- Simunovic, M., Brivanlou, A. H. Embryoids, organoids and gastruloids: new approaches to understanding embryogenesis. Development. 144, 976-985 (2017).
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Shahbazi, M. N., Zernicka-Goetz, M. Deconstructing and reconstructing the mouse and human early embryo. Nature Cell Biology. 20, 878-887 (2018).
- Li, Q., et al. Extracellular matrix scaffolding guides lumen elongation by inducing anisotropic intercellular mechanical tension. Nature Cell Biology. 18 (3), 311-318 (2016).
