Modelage de la géométrie des colonies de cellules souches embryonnaires humaines sur des substrats conformes pour contrôler la mécanique de niveau tissulaire
Summary
Les ligands de matrice extracellulaire peuvent être modelés sur des hydrogels de polyacrylamide pour permettre la culture des cellules souches embryonnaires humaines dans les colonies confinées sur des substrats conformes. Cette méthode peut être combinée avec la microscopie de force de traction et des essais biochimiques pour examiner l’interaction entre la géométrie de tissu, les forces cell-générées, et la spécification de destin.
Abstract
Les cellules souches embryonnaires humaines démontrent une capacité unique de répondre aux morphogènes in vitro par des modèles auto-organisés de spécification sépariane du destin cellulaire qui correspondent à la formation de couches germinales primaires pendant l’embryogenèse. Ainsi, ces cellules représentent un outil puissant pour examiner les mécanismes qui conduisent le développement humain précoce. Nous avons mis au point une méthode de culture de cellules souches embryonnaires humaines dans des colonies confinées sur des substrats conformes qui assure le contrôle de la géométrie des colonies et de leur environnement mécanique afin de récapituler les paramètres physiques qui sous-tendent l’embryogenèse. La caractéristique clé de cette méthode est la capacité de générer des hydrogels polyacrylamides avec des modèles définis de ligand matrice extracellulaire à la surface pour promouvoir l’attachement cellulaire. Ceci est réalisé en fabriquant des pochoirs avec les motifs géométriques désirés, en utilisant ces pochoirs pour créer des modèles de ligand de matrice extracellulaire sur des couvertures en verre, et en transférant ces modèles aux hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation. Cette méthode est également compatible avec la microscopie de force de traction, permettant à l’utilisateur de mesurer et de cartographier la distribution des forces générées par les cellules dans les colonies confinées. En combinaison avec des essais biochimiques standard, ces mesures peuvent être utilisées pour examiner le rôle des indices mécaniques jouer dans la spécification du destin et la morphogénèse au cours du développement humain précoce.
Introduction
Les cellules souches embryonnaires humaines (HESC) sont très prometteuses pour une utilisation dans les applications de médecine régénérative et d’ingénierie tissulaire. La nature pluripotente de ces cellules leur donne la capacité de se différencier en n’importe quel type de cellule adulte. Bien que de grands progrès aient été réalisés dans la direction du sort des HESC vers des types cellulaires particuliers, il est resté très difficile de générer des tissus entiers ou des organes de novo1,2,3,4, 5. Cela est dû, en grande partie, à une compréhension limitée des mécanismes qui conduisent la formation de ces tissus au cours du développement humain. Afin de combler cette lacune dans les connaissances, un certain nombre de méthodes ont émergé ces dernières années pour modéliser l’embryon précoce et les stades de développement ultérieurs avec des cellules souches embryonnaires6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Peu de temps après la dérivation des premières lignées hESC14, il a été démontré que les corps embryonnaires formés à partir de HESCs étaient capables de produire spontanément des cellules des trois couches germinales primaires6. Cependant, en raison du manque inhérent de contrôle sur la taille et la morphologie des corps embryonnaires, l’organisation des couches germinales variait considérablement et ne correspondait pas à l’organisation de l’embryon précoce. Plus récemment, Warmflash et coll. ont mis au point une méthode pour confiner les colonies de HESC sur des substrats de verre par micro-patterning, fournissant un contrôle et une cohérence sur la taille et la géométrie des colonies8. En présence de BMP4, un morphogène important dans le développement précoce, ces colonies confinées étaient capables d’auto-organiser des modèles reproductibles de spécification aux destins représentant les couches germinales primaires. Bien que cela ait fourni un modèle utile pour étudier les mécanismes par lesquels les couches germinales primaires sont établies, les modèles de spécification de destin ne correspondent pas exactement à l’organisation et à la morphogenèse observées pendant l’embryogenèse15. Une récapitulation plus fidèle du développement embryonnaire précoce a été réalisée en intégrant des HESC dans une matrice extracellulaire tridimensionnelle (ECM) de matrigel11, fournissant les preuves les plus solides à ce jour de la capacité des HESC à s’auto-organiser et à modéliser les premiers stades de l’embryogenèse ex vivo. Cependant, cette méthode donne des résultats incohérents et est donc incompatible avec un certain nombre d’essais qui pourraient être utilisés pour révéler les mécanismes sous-jacents de l’auto-organisation et la spécification du destin.
Compte tenu de ces méthodes existantes et de leurs limites respectives, nous avons cherché à développer une méthode de culture reproduction des colonies hESC de géométries définies dans des conditions qui modélisent l’environnement extracellulaire de l’embryon précoce. Pour ce faire, nous avons utilisé des hydrogels polyacrylamides d’élasticité réglable pour contrôler les propriétés mécaniques du substrat. En utilisant la microscopie de force atomique sur les embryons de poulet au stade de la gastrulation, nous avons constaté que l’élasticité de l’épiblaste variait de centaines de pascals à quelques kilopascals. Ainsi, nous nous sommes concentrés sur la production d’hydrogels de polyacrylamide avec l’élasticité dans cette gamme pour servir de substrat pour les colonies de hESC. Nous avons modifié nos méthodes précédentes de culture des hESC sur les hydrogels polyacrylamides7,9 afin de fournir un contrôle robuste sur la géométrie des colonies. Nous y sommes parvenus en faisant d’abord des glaçages eCM ligands, à savoir des matrigel, sur des feuilles de verre à travers des pochoirs microfabriqués, comme indiqué précédemment16. Nous avons ensuite conçu une nouvelle technique pour transférer le ligand à motifs à la surface des hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation. La méthode que nous décrivons ici consiste à utiliser la photolithographie pour fabriquer une plaquette de silicium avec les motifs géométriques souhaités, la création de timbres de thèses géométriques avec polydimethylsiloxane (PDMS), et en utilisant ces timbres pour générer les pochoirs qui finalement permettre le modelage de ligand sur la surface des feuilles de verre et de transférer à polyacrylamide.
En plus de récapituler l’environnement mécanique de l’embryon précoce, le confinement des colonies hESC sur le polyacrylamide permet de mesurer les forces générées par les cellules avec la microscopie de force de traction (TFM), tel que rapporté dans notre méthode précédente9. En bref, les perles fluorescentes peuvent être incorporées dans le polyacrylamide et utilisées comme marqueurs fiducial. Les forces générées par les cellules sont calculées en imagerie du déplacement de ces perles après l’ensemencement des HESC sur le substrat à motifs. En outre, les cartes de force de traction qui en résultent peuvent être combinées avec des essais traditionnels, tels que l’immunostaining, pour examiner comment la distribution des forces générées par les cellules dans les colonies hESC confinées peut réguler ou moduler la signalisation en aval. Nous nous attendons à ce que ces méthodes révèlent que les forces mécaniques jouent un rôle critique dans le modelage de la spécification du destin cellulaire au cours du développement embryonnaire précoce qui est actuellement négligé.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour simplifier un protocole long et détaillé, cette méthode se compose de trois étapes critiques : 1) la génération de modèles de ligand ECM sur des couvertures en verre, 2) le transfert des modèles aux hydrogels de polyacrylamide pendant la polymérisation du gel, et 3) les HESC d’ensemencement sur le hydrogel à motifs. Il y a des étapes critiques qui doivent être prises en considération à chacune de ces trois étapes. Afin de générer des modèles de haute fidélité sur les feuilles de verre, le pochoir…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à souligner le financement de la subvention RB5-07409 du CIRM. J.M.M. tient à remercier FuiBoon Kai, Dhruv Thakar et Roger Oria pour les différentes discussions qui ont guidé la génération et le dépannage de cette méthode. J.M.M. remercie également la bourse de découverte de l’UCSF pour le soutien continu de son travail.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Riferimenti
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