Musterung der Geometrie menschlicher embryonaler Stammzellkolonien auf konformen Substraten zur Kontrolle der Gewebe-Level-Mechanik
Summary
Extrazelluläre Matrixliganden können auf Polyacrylamid-Hydrogele gemustert werden, um die Kultur menschlicher embryonaler Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu ermöglichen. Diese Methode kann mit Traktionskraftmikroskopie und biochemischen Assays kombiniert werden, um das Zusammenspiel zwischen Gewebegeometrie, zellgenerierten Kräften und Schicksalsspezifikation zu untersuchen.
Abstract
Menschliche embryonale Stammzellen zeigen eine einzigartige Fähigkeit, auf Morphogene in vitro zu reagieren, indem sie selbstorganisierende Muster der Zellschicksalsspezifikation, die der primären Keimschichtbildung während der Embryogenese entsprechen. Somit stellen diese Zellen ein mächtiges Werkzeug dar, mit dem die Mechanismen untersucht werden können, die die frühe menschliche Entwicklung vorantreiben. Wir haben eine Methode entwickelt, um menschliche embryonale Stammzellen in geschlossenen Kolonien auf konformen Substraten zu kultivieren, die sowohl die Geometrie der Kolonien als auch ihre mechanische Umgebung kontrolliert, um die physikalischen Parameter zu rekapitulieren, die embryogenese. Das Hauptmerkmal dieser Methode ist die Fähigkeit, Polyacrylamid-Hydrogele mit definierten Mustern von extrazellulärem Matrixliganden an der Oberfläche zu erzeugen, um die Zellanhaftung zu fördern. Dies wird erreicht, indem Schablonen mit den gewünschten geometrischen Mustern hergestellt, diese Schablonen verwendet werden, um Muster aus extrazellulärem Matrixliganden auf Glasabdeckungen zu erzeugen, und diese Muster während der Polymerisation auf Polyacrylamid-Hydrogele übertragen werden. Diese Methode ist auch mit der Traktionskraftmikroskopie kompatibel, so dass der Benutzer die Verteilung der zellgenerierten Kräfte innerhalb der begrenzten Kolonien messen und abbilden kann. In Kombination mit biochemischen Standardtests können diese Messungen verwendet werden, um die Rolle zu untersuchen, die mechanische Hinweise bei der Schicksalsspezifikation und Morphogenese bei der frühen menschlichen Entwicklung spielen.
Introduction
Menschliche embryonale Stammzellen (hESCs) versprechen den Einsatz in der regenerativen Medizin und in der Gewebetechnik. Die pluripotente Natur dieser Zellen gibt ihnen die Möglichkeit, in jeden adulten Zelltyp zu differenzieren. Während große Fortschritte bei der Leitung des Schicksals von hESCs auf bestimmte Zelltypen gemacht wurden, ist es sehr schwierig geblieben, ganze Gewebe oder Organe de novo1,2,3,4, 5. Dies ist zu einem großen Teil auf ein begrenztes Verständnis der Mechanismen zurückzuführen, die die Bildung dieser Gewebe während der menschlichen Entwicklung vorantreiben. Um diese Wissenslücke zu schließen, sind in den letzten Jahren eine Reihe von Methoden zur Modellierung des frühen Embryos und der nachfolgenden Entwicklungsstadien mit embryonalen Stammzellen6,7,8,9 ,10,11,12,13.
Kurz nach der Ableitung der ersten hESC-Linien14wurde nachgewiesen, dass embryoide Körper aus hESCs in der Lage waren, spontan Zellen der drei primären Keimschichten6zu produzieren. Aufgrund der inhärenten mangelnden Kontrolle über die Größe und Morphologie von embryoiden Körpern variierte die Organisation der Keimschichten jedoch erheblich und entsprach nicht der Organisation des frühen Embryos. In jüngerer Zeit entwickelten Warmflash et al. eine Methode, um Kolonien von hESCs auf Glassubstraten mittels Mikromusterung einzugrenzen, die Kontrolle und Konsistenz über die Größe und Geometrie derKolonien8 . In Gegenwart von BMP4, einem wichtigen Morphogen in der frühen Entwicklung, waren diese begrenzten Kolonien in der Lage, sich selbst reproduzierbare Spezifisierungsmuster an Schicksale zu organisieren, die die primären Keimschichten darstellen. Obwohl dies ein nützliches Modell für die Untersuchung der Mechanismen darstellte, mit denen primäre Keimschichten hergestellt werden, entsprachen die Muster der Schicksalsspezifikation nicht genau der Organisation und Morphogenese, die während der Embryogenese15beobachtet wurden. Eine getreuere Rekapitulation der frühen embryonalen Entwicklung wurde erreicht, indem hESCs in eine dreidimensionale extrazelluläre Matrix (ECM) von Matrigel11eingebettet wurden, was den bisher stärksten Beweis für die Fähigkeit von hESCs zur Selbstorganisation und Modellierung lieferte. die frühen Stadien der Embryogenese ex vivo. Diese Methode führt jedoch zu inkonsistenten Ergebnissen und ist daher unvereinbar mit einer Reihe von Assays, die verwendet werden könnten, um die zugrunde liegenden Mechanismen der Selbstorganisation und Schicksalsspezifikation aufzudecken.
Angesichts dieser bestehenden Methoden und ihrer jeweiligen Grenzen versuchten wir, eine Methode zur reproduzierbaren Kultivierung von hESC-Kolonien definierter Geometrien unter Bedingungen zu entwickeln, die die extrazelluläre Umgebung des frühen Embryos modellieren. Um dies zu erreichen, verwendeten wir Polyacrylamid-Hydrogele mit abstimmbarer Elastizität, um die mechanischen Eigenschaften des Substrats zu steuern. Mit Hilfe der Atomkraftmikroskopie an Hühnerembryonen im Gastrulationsstadium fanden wir heraus, dass die Elastizität des Epiblasts von Hunderten von Pascal bis zu einigen Kilopascal reichte. So konzentrierten wir uns auf die Erzeugung von Polyacrylamid-Hydrogelen mit Elastizität in diesem Bereich, um als Substrat für hESC-Kolonien zu dienen. Wir haben unsere bisherigen Methoden zur Kultivierung von hESCs auf Polyacrylamid-Hydrogelen7,9 modifiziert, um eine robuste Kontrolle über die Geometrie der Kolonien zu ermöglichen. Dies gelang uns durch das erste Mustern von ECM-Liganden, nämlich Matrigel, auf Glashüllen durch mikrofabrizierte Schablonen, wie bereits berichtet16. Wir haben dann eine neuartige Technik entwickelt, um den gemusterten Liganden während der Polymerisation auf die Oberfläche von Polyacrylamid-Hydrogelen zu übertragen. Die Methode, die wir hier beschreiben, besteht darin, die Photolithographie zu verwenden, um einen Siliziumwafer mit den gewünschten geometrischen Mustern herzustellen, Stempel dieser geometrischen Merkmale mit Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erstellen und diese Stempel zu verwenden, um die Schablonen zu erzeugen, die schließlich erlauben, Denligand auf die Oberfläche von Glasabdeckungen zu mustern und zu Polyacrylamid zu übertragen.
Neben der Rekapitulation der mechanischen Umgebung des frühen Embryos ermöglicht die Beschränkung von hESC-Kolonien auf Polyacrylamid die Messung zellgenerierter Kräfte mit Traktionskraftmikroskopie (TFM), wie in unserer vorherigen Methode9berichtet. Kurz gesagt, fluoreszierende Perlen können in das Polyacrylamid eingebettet und als Treuhandmarker verwendet werden. Zellgenerierte Kräfte werden berechnet, indem die Verschiebung dieser Perlen nach dem Aussaat von hESCs auf das gemusterte Substrat abgebildt wird. Darüber hinaus können die resultierenden Traktionskraftkarten mit traditionellen Assays wie Derimmunfärbung kombiniert werden, um zu untersuchen, wie die Verteilung zellgenerierter Kräfte in begrenzten hESC-Kolonien die nachgeschaltete Signalisierung regulieren oder modulieren kann. Wir erwarten, dass diese Methoden zeigen werden, dass mechanische Kräfte eine entscheidende Rolle bei der Musterung der Zellschicksalsspezifikation während der frühen embryonalen Entwicklung spielen, die derzeit übersehen wird.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um ein langes und detailliertes Protokoll zu vereinfachen, besteht diese Methode aus drei kritischen Stufen: 1) Erzeugung von ECM-Ligand auf Glasabdeckungen, 2) Übertragung der Muster auf Polyacrylamid-Hydrogele während der Polymerisation des Gels und 3) Saat-HESCs auf der gemusterten Hydrogel. Es gibt kritische Schritte, die in jeder dieser drei Phasen berücksichtigt werden müssen. Um auf den Glasabdeckungen Hochtreuemuster zu erzeugen, muss die Schablone fest auf den Deckelbeschlag gedrückt werden, um ein Auslaufe…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir möchten die Finanzierung aus dem CIRM-Zuschuss RB5-07409 bestätigen. J.M.M. dankt FuiBoon Kai, Dhruv Thakar und Roger Oria für verschiedene Diskussionen, die die Generierung und Fehlerbehebung dieser Methode geleitet haben. J.M.M. dankt auch dem UCSF Discovery Fellowship für die kontinuierliche Unterstützung seiner Arbeit.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Riferimenti
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