ऊतक-स्तरीय यांत्रिकी को नियंत्रित करने के लिए अनुपालन सबस्ट्राट्स पर मानव भ्रूण स्टेम सेल कालोनियों की ज्यामिति का पैटर्न
Summary
बाह्यकोशिकीय मैट्रिक्स लिगन्ड्स को पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल्स पर पैटर्न किया जा सकता है ताकि संगत उपस्ट्रियों पर सीमित कालोनियों में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की संस्कृति को सक्षम किया जा सके। इस विधि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी और जैव रासायनिक assays के साथ जोड़ा जा सकता है ऊतक ज्यामिति के बीच परस्पर क्रिया की जांच करने के लिए, सेल जनित बलों, और भाग्य विनिर्देश.
Abstract
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं कोशिका भाग्य विनिर्देश है कि भ्रूणजनन के दौरान प्राथमिक रोगाणु परत गठन के अनुरूप स्वयं आयोजन पैटर्न द्वारा इनविट्रो में morphogens के लिए प्रतिक्रिया करने के लिए एक अद्वितीय क्षमता का प्रदर्शन. इस प्रकार, इन कोशिकाओं के साथ जो तंत्र है कि जल्दी मानव विकास ड्राइव की जांच करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करते हैं. हम अनुरूप substrates पर सीमित कालोनियों में मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं संस्कृति के लिए एक विधि विकसित की है कि कालोनियों और उनके यांत्रिक पर्यावरण दोनों की ज्यामिति पर नियंत्रण प्रदान करता है ताकि शारीरिक मापदंडों recapitulate करने के लिए कि भ्रूणजनन को कम करना। इस विधि की प्रमुख विशेषता सेल लगाव को बढ़ावा देने के लिए सतह पर extracellular मैट्रिक्स ligand के परिभाषित पैटर्न के साथ polyacrylamide hydrogels उत्पन्न करने की क्षमता है. यह वांछित ज्यामितीय पैटर्न के साथ स्टेंसिल ों fabricating द्वारा हासिल की है, इन स्टेंसिल का उपयोग करने के लिए कांच coverslips पर extracellular मैट्रिक्स ligand के पैटर्न बनाने के लिए, और बहुलकीकरण के दौरान polyacrylamide hydrogels के लिए इन पैटर्न स्थानांतरित. इस विधि कर्षण बल माइक्रोस्कोपी के साथ भी संगत है, उपयोगकर्ता को मापने के लिए और सीमित कालोनियों के भीतर सेल जनित बलों के वितरण को मैप करने की अनुमति. मानक जैव रासायनिक परख के साथ संयोजन में, इन माप जल्दी मानव विकास के दौरान भाग्य विनिर्देश और morphogenesis में भूमिका यांत्रिक संकेतों खेलने की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Introduction
मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ESCs) पुनर्योजी चिकित्सा और ऊतक इंजीनियरिंग अनुप्रयोगों में उपयोग के लिए महान वादा पकड़. इन कोशिकाओं की बहुरूपी प्रकृति उन्हें किसी भी वयस्क कोशिका प्रकार में अंतर करने की क्षमता प्रदान करता है। जबकि HESCs के भाग्य को विशेष कोशिका प्रकारों के लिए निर्देशित करने में काफी प्रगति की गई है , पूरे ऊतकों या अंगों को उत्पन्न करना बहुत मुश्किल रहा है ,2,3,4, 5. यह कारण है, बड़े हिस्से में, तंत्र है कि मानव विकास के दौरान इन ऊतकों के गठन ड्राइव की एक सीमित समझ के लिए. ज्ञान में इस अंतर को भरने के लिए, हाल के वर्षों में भ्रूण स्टेम कोशिकाओं6,7,8,9 के साथ प्रारंभिक भ्रूण और बाद के विकास के चरणों को मॉडल करने के लिए कई तरीके सामने आएहैं। ,10,11,12,13.
14की पहली एचईएससी लाइनों के व्युत्पत्ति के कुछ ही समय बाद यह प्रदर्शित किया गया कि एचईएससी से बने भ्रूणीय शरीर तीन प्राथमिक रोगाणु परतों6की कोशिकाओं को स्वत : उत्पन्न करने में सक्षम थे . हालांकि, भ्रूणीय निकायों के आकार और आकारिकी पर नियंत्रण की अंतर्निहित कमी के कारण, रोगाणु परतों के संगठन में काफी भिन्नता है और प्रारंभिक भ्रूण के संगठन से मेल खाने में विफल रहा है। हाल ही में, Warmflash एट अल एक विधि विकसित करने के लिए micropatterning के माध्यम से कांच substrates पर hESCs की कालोनियों को सीमित करने के लिए, नियंत्रण और कालोनियों के आकार और ज्यामिति पर स्थिरता प्रदान8. BMP4 की उपस्थिति में, प्रारंभिक विकास में एक महत्वपूर्ण morphogen, इन सीमित कालोनियों प्राथमिक रोगाणु परतों का प्रतिनिधित्व करने के लिए विनिर्देश के reproduible पैटर्न स्वयं व्यवस्थित करने में सक्षम थे. यद्यपि इसने उन तंत्रों का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी मॉडल प्रदान किया जिनके द्वारा प्राथमिक रोगाणु परतें स्थापित की जाती हैं, भाग्य विनिर्देश के पैटर्न भ्रूणजनन15के दौरान देखे गए संगठन और रूपजनन से सटीक रूप से मेल नहीं खाते थे। जल्दी भ्रूण विकास के एक अधिक वफादार recapitulation matricgel11के एक तीन आयामी extracellular मैट्रिक्स (ECM) में HESCs embedding द्वारा प्राप्त किया गया था , स्वयं को संगठित करने और मॉडल के लिए HESCs की क्षमता के लिए तारीख करने के लिए सबसे मजबूत सबूत प्रदान भ्रूणजनन पूर्व विवो की प्रारंभिक अवस्था. हालांकि, इस विधि असंगत परिणाम पैदावार और इस प्रकार assays कि स्वयं संगठन और भाग्य विनिर्देश के अंतर्निहित तंत्र प्रकट करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक संख्या के साथ असंगत है.
इन मौजूदा तरीकों और उनके संबंधित सीमाओं को देखते हुए, हम परिस्थितियों में परिभाषित geometries के ESC कालोनियों reproducibly culturing के लिए एक विधि विकसित करने की मांग की है कि जल्दी भ्रूण के extracellular वातावरण मॉडल. इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए, हमने सब्सट्रेट के यांत्रिक गुणों को नियंत्रित करने के लिए टूनाबल लोच के पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोजेल्स का उपयोग किया। गैस्ट्रेशन-स्टेज चिकन भ्रूणों पर परमाणु बल माइक्रोस्कोपी का उपयोग करते हुए हमने पाया कि एपिब्लास्ट की लोच सैकड़ों पैस्कलों से लेकर कुछ किलोपैस्कल तक होती है। इस प्रकार, हम इस श्रेणी में लोच के साथ polyacrylamide hydrogels पैदा करने पर ध्यान केंद्रित करने के लिए ESC कालोनियों के लिए सब्सट्रेट के रूप में सेवा करते हैं. हमने कालोनियों की ज्यामिति पर मजबूत नियंत्रण प्रदान करने के लिए पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोगेल्स7,9 पर एचएसईएससी की गणना के लिए अपने पिछले तरीकों को संशोधित किया है। हम पहले पैटर्न ईसीएम ligands द्वारा यह हासिल की, अर्थात् matrigel, माइक्रोफेब्रिफेब्रिकेड स्टेंसिल के माध्यम से कांच coverslips पर, जैसा कि पहले16की सूचना दी. हम तो बहुलकीकरण के दौरान polyacrylamide hydrogels की सतह के लिए पैटर्न लिगन्ड हस्तांतरण करने के लिए एक उपन्यास तकनीक डिजाइन. विधि हम यहाँ का वर्णन photolithgraphy का उपयोग करने के लिए वांछित ज्यामितीय पैटर्न के साथ एक सिलिकॉन वेफर बनाना शामिल है, polydimethylsilxane (PDMS) के साथ इन ज्यामितीय सुविधाओं के टिकटों का निर्माण, और इन टिकटों का उपयोग करने के लिए स्टेंसिल उत्पन्न करते हैं कि अंततः कांच coverslips की सतह पर ligand के पैटर्न की अनुमति और polyacrylamide करने के लिए स्थानांतरण.
प्रारंभिक भ्रूण के यांत्रिक वातावरण को पुन: लागू करने के अलावा, पॉलीऐक्रिलमाइड पर हेसेक कालोनियों को सीमित करने से कर्षण बल माइक्रोस्कोपी (टीएफएम) के साथ सेल जनित बलों की माप सक्षम होती है, जैसा कि हमारी पिछली विधि9में बताया गया है। संक्षेप में, फ्लोरोसेंट मोती polyacrylamide में एम्बेडेड और fiducial मार्करों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. सेल जनित बलों पैटर्न सब्सट्रेट पर HESCs बोने के बाद इन मोती के विस्थापन इमेजिंग द्वारा गणना कर रहे हैं. इसके अलावा, जिसके परिणामस्वरूप कर्षण बल नक्शे पारंपरिक assays के साथ जोड़ा जा सकता है, इस तरह के इम्यूनोस्टेनिंग के रूप में, जांच करने के लिए कैसे सीमित HESC कालोनियों में सेल जनित बलों के वितरण को विनियमित या बहाव संकेतन modulate कर सकते हैं. हम इन तरीकों से पता चलता है कि यांत्रिक बलों जल्दी भ्रूण विकास है कि वर्तमान में अनदेखी की है के दौरान सेल भाग्य विनिर्देश के पैटर्न में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं उम्मीद है.
Protocol
Representative Results
Discussion
एक लंबी और विस्तृत प्रोटोकॉल को सरल बनाने के लिए, इस विधि में तीन महत्वपूर्ण चरण होते हैं: 1) कांच के कवरलिप्स पर ईसीएम लिगन्ड के पैटर्न पैदा करना, 2) जेल की बहुलकीकरण के दौरान पॉलीऐक्रिलमाइड हाइड्रोगेल्स…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम CIRM अनुदान RB5-07409 से धन स्वीकार करना चाहते हैं. J.M.M. FuiBoon काई, ध्रुव Thakar, और रोजर Oria विभिन्न विचार विमर्श है कि पीढ़ी और इस विधि की समस्या निवारण निर्देशित के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं. जे.एम.एम. भी अपने काम के चल रहे समर्थन के लिए UCSF डिस्कवरी फैलोशिप धन्यवाद.
Materials
| 0.05% Trypsin | Gibco | 25300054 | |
| 100 mm glass petri dish | Fisher Scientific | 08-747B | |
| 100 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875712 | |
| 15 mL conical-bottom tubes | Corning | 352095 | |
| 150 mm plastic petri dish | Fisher Scientific | FB0875714 | |
| 18 mm diameter #1 coverslips | Thermo Scientific | 18CIR-1 | |
| 2% bisacrylamide | Bio-Rad | 161-0142 | |
| 3-aminopropyltrimethoxysilane | ACROS Organics | 313251000 | |
| 40% acrylamide | Bio-Rad | 161-0140 | |
| Aluminum foil | Fisher Scientific | 01-213-100 | |
| Basic fibroblast growth factor | Sigma-Aldrich | F0291 | |
| Bleach | Clorox | N/A | |
| Centrifuge with swing-buckets | Eppendorf | 22623508 | Model: 5804 R |
| Collagen | Corning | 354236 | |
| Dessicator | Fisher Scientific | 08-642-7 | |
| Ethanol | Fisher Scientific | AC615095000 | |
| Fetal bovine serum | Gibco | 16000044 | |
| Fluorescent microspheres | Thermo Scientific | F8821 | |
| Forceps (for coverslips) | Fisher Scientific | 16-100-122 | |
| Forceps (for wafers) | Fisher Scientific | 17-467-328 | |
| Gel holders | N/A | N/A | Gel holders are custom 3D-printed, CAD drawing available on request |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-261-94 | |
| HEPES | Thermo Scientific | J16926A1 | |
| Hot plate | Fisher Scientific | HP88854100 | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144S-500 | |
| Isopropyl alcohol | Fisher Scientific | A416-500 | |
| Kimwipes (delicate task wipes) | Kimberly-Clark Professional | 34120 | |
| Knockout serum replacement | Gibco | 10828028 | |
| Knockout-DMEM | Gibco | 10829018 | |
| Mask aligner (for photolithography) | Karl Suss America, Inc. | Karl Suss MJB3 Mask Aligner | |
| Matrigel | Corning | 354277 | |
| Microscope for traction force | Nikon | N/A | Model: Eclipse TE200 U |
| Motorized positioning stage | Prior Scientific | N/A | Model: HLD117 |
| Nitrogen gas | Airgas | NI 250 | |
| Norland optical adhesive 74 (UV-curable polymer) | Norland Products | NOA 74 | |
| Oven | Thermo Scientific | PR305225G | |
| Parafilm (laboratory film) | Fisher Scientific | 13-374-12 | |
| PDMS (Sylgard 184) | Fisher Scientific | NC9285739 | |
| Photomask | CAD/Art Services, Inc. | N/A | Photomasks are custom made. CAD drawing for our designs available upon request |
| Plasma cleaner | Fisher Scientific | NC9332171 | |
| Plastic for gasket | Marian Chicago | HT6135 | |
| Plastic for spacer | TAP Plastics | N/A | Polycarbonate sheet, .01 inch thickness |
| Potassium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | P217-500 | |
| Potassium phosphate monobasic (for making PBS) | Fisher Scientific | P285-500 | |
| Pottassium persulfate | ACROS Organics | 424185000 | |
| Scalpel | Fisher Scientific | 14-840-00 | |
| Silicon wafer | Electron Microscopy Sciences | 71893-06 | Type P, 3 inch, silicon wafers |
| Sodium chloride (for making PBS) | Fisher Scientific | S271-1 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-100 | |
| Sodium phosphate dibasic dihydrate (for making PBS) | Fisher Scientific | S472-500 | |
| SU8-3050 Photoresist | MicroChem | SU8-3000 | |
| SU8-Developer | MicroChem | Y020100 | |
| TEMED | Bio-Rad | 161-0800 | |
| UV-sterilization box | Bio-Rad | N/A | Bio-Rad GS Gene Linker UV Chamber |
| Y27632 (Rho kinase inhibitor) | StemCell Technologies | 72304 |
Riferimenti
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